【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鉴定方法，更具体一点说，涉及一种酵母中必需基因的鉴定方法，属于生物基因工程领域。
技术介绍
1、酵母作为一种能用于研究基因功能和调控的理想生物模型，通过基因敲除、过表达或突变，可以详细探究不同基因对生命过程的影响对生物学研究有着深远意义。正向遗传法是筛选未知功能基因的方法之一，通过大规模随机诱变，产生发育异常的突变个体，然后再寻找突变的基因，但这种传统的诱变方法筛选得到的突变株周期长、效率低且基因型难以鉴定。
2、在酵母中，确定必需基因的集合是相对直接的，因为酵母的基因组非常紧凑且能够高效地完成基因重组，这使得在其正常染色体中精确缺失基因成为可能。酵母的基因缺失能够在二倍体细胞中进行，引导二倍体细胞进行减数分裂，产生只含有精确敲除基因的单倍体细胞若无法生长，则证明这个突变基因是对细胞分裂非常重要的基因。flp-frt同向条件性敲除系统是利用酵母中的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白flp重组酶构建条件性基因敲除系统，flp经过特定条件启动后识别frt位点且敲除同向frt位点之间基因及一个frt序列。flp识别位点frt:gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供具有能够根据报告基因表达及菌株生长情况准确判断该基因是否为必需基因等技术特点的一种酵母中必需基因的鉴定方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、
4、步骤1)单交换质粒构建：确定待测基因及其同源臂，将待测基因的3’同源臂、flp重组酶、启动子、frt序列、抗性筛选基因接入酵母诱导型表达载体，组成第一步单交换质粒；
5、步骤2)：在第一步单交换质粒同源臂上设计线性化引物进行质粒线性化，回收后电转至野生型x33酵母感受态细胞中，阳性克隆制备成感受态存储于-80℃冰箱中；
6、步骤3)：第二步单交换质粒构建：将待测基因的5’同源臂、avi标签、荧光报告基因、抗性基因、frt序列元件组合到酵母表达载体上，组成第二步单交换质粒；
7、步骤4)：在第二步单交换质粒同源臂上设计线性化引物进行质粒线性化，回收后电转至步骤2)中制备完成的感受态细胞中以实现第二步单交换质粒转入第一步单交换菌株感受态细胞中；
8、步骤5)：挑选阳性克隆，诱导flp表达并敲除待测基因；
9、步骤6)：荧光显微镜下观察报告基因是否表达，表达则待测基因已成功敲除，若酵母株不再生长则该基因则为必需基因。
10、优选的，步骤1)中所述抗性筛选基因为bsd抗性筛选基因，其引入了flp重组酶和frt序列位点。
11、优选的，步骤3)中所述荧光报告基因为gfp绿色荧光蛋白。
12、优选的，步骤3)抗性基因为bleor抗性筛选基因。
13、优选的，步骤5)中是将第二步单交换质粒阳性菌株于bmgy中培养后诱导敲除待测基因。
14、优选的，在数据库中找到待测基因在基因组中的位置，在其前后的1kp序列分别为5’同源臂和3’同源臂。
15、有益效果：通过引入被鉴定基因的同源臂、flp重组酶及其识别位点、报告基因、抗性筛选基因，通过诱导表达敲除目的基因，最终根据报告基因表达及菌株生长情况准确判断该基因是否为必需基因。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于鉴定方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中所述抗性筛选基因为BSD抗性筛选基因，其引入了FLP重组酶和FRT序列位点。
3.根据权利要求1所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中所述荧光报告基因为GFP绿色荧光蛋白。
4.根据权利要求1或3所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，步骤3)抗性基因为BleoR抗性筛选基因。
5.根据权利要求1所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，步骤5)中是将第二步单交换质粒阳性菌株于BMGY中培养后诱导敲除待测基因。
6.根据权利要求1所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，在数据库中找到待测基因在基因组中的位置，在其前后的1kp序列分别为5’同源臂和3’同源臂。
【技术特征摘要】
1.一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于鉴定方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中所述抗性筛选基因为bsd抗性筛选基因，其引入了flp重组酶和frt序列位点。
3.根据权利要求1所述的一种酵母中必需基因的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中所述荧光报告基因为gfp绿色荧光蛋白。
4.根据权利要求1或3所述的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑清，杨俊杰，陈国栋，唐文杰，吕正兵，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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