【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化应用，涉及催化co2合成乙醇的多酶级联反应途径。
技术介绍
1、当今世界面临的能源危机和环境问题引起了全球对可持续可再生能源的广泛关注。生物燃料可以在更大程度上减少对化石能源的需求，对缓解能源危机和转变能源结构有着重要的战略意义。生物乙醇是一种重要的可再生生物液体燃料已成为工业生物
重要部分，现已部分替代汽油作为车用燃料。2021年，要大力实施可再生能源替代，积极扩大先进生物液体燃料等新能源、清洁能源在交通运输领域应用，这种政策扶持将进一步加速生物乙醇的发展趋势。
2、现阶段，生物乙醇技术已逐步由一代粮食燃料乙醇经二代纤维素燃料乙醇向三代以co2为原料绿色低碳型燃料乙醇转化。其中一代生物燃料乙醇主要以淀粉/葡萄糖含量丰富的玉米、甘蔗、大豆等农产品为原料(renew.sust.energ.rev.,2021,135,110387)，采用粉碎、发酵、蒸馏等过程制备，然而其“与粮争地、与人争粮”的原料供应模式以及发酵法导致的环境污染问题引发了极大的社会争议；二代纤维素燃料乙醇是以木质纤维素等农业、林业废弃物为原料的乙醇合成技术(ind.crop.prod.,2022,188,115569)，极大程度缓解了“粮食乙醇”在原料供应上的不足，但是纤维素原料的预处理及酶解糖化过程需要消耗大量能量、水和纤维素酶，从而造成生产成本高昂和污水处理等问题；与前两代生物乙醇技术相比，以co2为原料绿色低碳型燃料乙醇通过酶或细胞工厂催化直接转化为乙醇的技术路线(nat.catal.,2020,3,274-288)，
3、目前以co2为原料绿色低碳第三代生物燃料技术正在加强科技攻关，将推动生物能源重要领域变革性发展。在自然界中甲基营养型细菌通过磷酸核酮糖途径或丝氨酸循环合成乙醇前驱体(乙酰辅酶a)。然而，天然甲基营养型微生物的磷酸核酮糖途径碳原子利用率只有67％，而丝氨酸循环途径需要额外的补充足量的atp来维持反应。碳原子损失或atp消耗是现有co2高值化转化利用途径一直以来需要解决而尚未解决的难题；另外co2活化关键酶的低还原活性和稳定性也是co2转化利用途径的主要挑战。因此，非常有必要利用生物大数据开发高还原活性、高稳定性的co2活化关键酶，并结合现有的先进技术和开发新的技术，利用合成代谢的优势，构建非atp依赖型100％碳原子经济的多酶级联催化co2合成乙醇途径，弥补当前co2合成乙醇代谢通路匮乏问题，为以co2为原料全链条生物合成乙醇以及下游高值化学品提供全新绿色技术路线和研究思路。
技术实现思路
1、本专利技术基于以co2为原料的第三代生物燃料绿色低碳技术加强科技攻关的背景，针对目前无高效co2合成乙醇代谢通路、多酶反应平衡难控制的技术问题，提供了一种催化co2合成乙醇的多酶级联反应途径。该多酶级联反应途径通过耦合co2高效活化、甲醛→乙酰辅酶a、乙醇合成功能模块，以及优化反应条件，实现co2高效活化转化合成乙醇，为以co2为原料全链条生物合成乙醇提供了全新绿色技术路线。
2、为此，本专利技术第一方面提供了一种催化co2合成乙醇的多酶级联反应途径，所述途径包括：以co2为原料，首先通过甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶将co2活化为甲醛，然后通过自主构建的人工代谢途径将甲醛转化为乙酰辅酶a，再进一步通过乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶将乙酰辅酶a合成为乙醇。
3、根据本专利技术第一方面的一些实施方式，所述多酶级联催化co2合成乙醇的途径包括利用甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶2种酶级联催化实现co2活化为甲醛，甲醛进入人工代谢途径，其中果糖-6-磷酸在磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶的作用下转化为乙酰辅酶a，乙酰辅酶a进一步在乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶2种酶级联催化作用下转化为乙醇；
4、所述甲酸脱氢酶为具有催化co2合成甲酸功能的相关酶；所述甲醛脱氢酶为具有催化甲酸合成甲醛功能的相关酶；所述乙醛脱氢酶为具有催化乙酰辅酶a合成乙醛功能的相关酶；所述乙醇脱氢酶为具有催化乙醛合成乙醇功能的相关酶；
5、优选地，所述甲酸脱氢酶包括fdhpa酶；所述甲醛脱氢酶bmfalddh酶和/或asfalddh酶；所述乙醛脱氢酶包括pdup酶；所述乙醇脱氢酶包括adh酶。
6、根据本专利技术第一方面的一些实施方式，所述人工代谢途径包括甲醛首先结合核酮糖-5-磷酸在磷酸己酮糖合成酶的作用下转化为己酮糖-6-磷酸，然后己酮糖-6-磷酸在磷酸己酮糖异构酶的作用下转化为果糖-6-磷酸，进一步果糖-6-磷酸(一分子)在6-磷酸果糖磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶的级联催化作用下转化为乙酰辅酶a，另一分子果糖-6-磷酸结合生成的赤藓糖-4-磷酸通过一系列涉及转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶和磷酸核酮糖差向异构酶的反应再生两分子核酮糖-5-磷酸完成循环反应；
7、所述磷酸己酮糖合成酶为具有催化甲醛和核酮糖-5-磷酸合成己酮糖-6-磷酸功能的相关酶；所述磷酸己酮糖异构酶为具有催化己酮糖-6-磷酸合成果糖-6-磷酸功能的相关酶；所述6-磷酸果糖磷酸转酮酶为具有催化果糖-6-磷酸合成乙酰磷酸功能的相关酶；所述磷酸乙酰转移酶为具有催化乙酰磷酸合成乙酰辅酶a功能的相关酶；所述转醛酶为具有催化果糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸合成3-磷酸甘油醛和景天庚酮糖-7-磷酸功能的相关酶；所述转酮酶为具有催化3-磷酸甘油醛和景天庚酮糖-7-磷酸合成核糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸功能的相关酶；所述磷酸核酮糖异构酶为具有催化核糖-5-磷酸合成核酮糖-5-磷酸功能的相关酶；所述磷酸核酮糖差向异构酶为具有催化木酮糖-5-磷酸合成核酮糖-5-磷酸功能的相关酶；
8、优选地，所述磷酸己酮糖合成酶包括hps酶；所述磷酸己酮糖异构酶包括phi酶；所述6-磷酸果糖磷酸转酮酶包括fpk酶；所述磷酸乙酰转移酶包括pta酶；所述转醛酶包括tal酶；所述转酮酶包括tkt酶；所述磷酸核酮糖异构酶包括rpi酶；所述磷酸核酮糖差向异构酶包括rpe酶。
9、本专利技术第二方面提供了一种多酶级联反应催化co2合成乙醇的方法，所述方法包括：将甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、磷酸己酮糖合成酶、磷酸己酮糖异构酶、6-磷酸果糖磷酸转酮酶、磷酸乙酰转移酶、转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶、磷酸核酮糖差向异构酶、乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶、辅酶nadh、焦磷酸硫胺素tpp、辅酶a、核糖-5-磷酸、无水硫酸镁和缓冲液混合，向混合液中通入co2进行催化反应，检测乙醇生成浓度。
10、所述甲酸脱氢酶为具有催化co2合成甲酸功能的相关酶；所述甲醛脱氢酶为具有催化甲酸合成甲醛功能的相关酶；所述磷酸己酮糖合成酶为具有催化甲醛和核酮糖-5-磷酸合成己酮糖-6-磷酸功能的相关酶；所述磷酸己酮糖异构酶为具有催化己酮糖-6-磷酸合成果糖-6-磷酸功能的相关酶；所述6-磷酸果糖磷酸转酮酶为具有催化果糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种催化CO2合成乙醇的多酶级联反应途径，所述途径包括：以CO2为原料，首先通过甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶将CO2活化为甲醛，然后通过自主构建的人工代谢途径将甲醛转化为乙酰辅酶A，再进一步通过乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶将乙酰辅酶A合成为乙醇。
2.根据权利要求1所述的多酶级联途径，其特征在于，所述多酶级联催化CO2合成乙醇的途径包括利用甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶2种酶级联催化实现CO2活化为甲醛，甲醛进入人工代谢途径，其中果糖-6-磷酸在磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶的作用下转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进一步在乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶2种酶级联催化作用下转化为乙醇；
3.根据权利要求2所述的人工代谢途径，其特征在于，首先甲醛结合核酮糖-5-磷酸在磷酸己酮糖合成酶的作用下转化为己酮糖-6-磷酸，然后己酮糖-6-磷酸在磷酸己酮糖异构酶的作用下转化为果糖-6-磷酸，进一步果糖-6-磷酸(一分子)在6-磷酸果糖磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶的级联催化作用下转化为乙酰辅酶A，另一分子果糖-6-磷酸结合生成的赤藓糖-4-磷酸通过一系列涉及转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶和磷酸核酮糖差向
4.一种多酶级联反应催化CO2合成乙醇的方法，所述方法包括：将甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、磷酸己酮糖合成酶、磷酸己酮糖异构酶、6-磷酸果糖磷酸转酮酶、磷酸乙酰转移酶、转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶、磷酸核酮糖差向异构酶、乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶、辅酶NADH、焦磷酸硫胺素TPP、辅酶A、核糖-5-磷酸、无水硫酸镁和缓冲液混合，向混合液中通入CO2进行催化反应，检测乙醇生成浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶为具有催化CO2合成甲酸功能的相关酶；所述甲醛脱氢酶为具有催化甲酸合成甲醛功能的相关酶；所述磷酸己酮糖合成酶为具有催化甲醛和核酮糖-5-磷酸合成己酮糖-6-磷酸功能的相关酶；所述磷酸己酮糖异构酶为具有催化己酮糖-6-磷酸合成果糖-6-磷酸功能的相关酶；所述6-磷酸果糖磷酸转酮酶为具有催化果糖-6-磷酸合成乙酰磷酸功能的相关酶；所述磷酸乙酰转移酶为具有催化乙酰磷酸合成乙酰辅酶A功能的相关酶；所述转醛酶为具有催化果糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸合成3-磷酸甘油醛和景天庚酮糖-7-磷酸功能的相关酶；所述转酮酶为具有催化3-磷酸甘油醛和景天庚酮糖-7-磷酸合成核糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸功能的相关酶；所述磷酸核酮糖异构酶为具有催化核糖-5-磷酸合成核酮糖-5-磷酸功能的相关酶；所述磷酸核酮糖差向异构酶为具有催化木酮糖-5-磷酸合成核酮糖-5-磷酸功能的相关酶；所述乙醛脱氢酶为具有催化乙酰辅酶A合成乙醛功能的相关酶；所述乙醇脱氢酶为具有催化乙醛合成乙醇功能的相关酶；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、磷酸己酮糖合成酶、磷酸己酮糖异构酶、6-磷酸果糖磷酸转酮酶、磷酸乙酰转移酶、转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶、磷酸核酮糖差向异构酶、乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶12种酶的比例为(0.1～20)：(0.1～20)：(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～10)：(0.1～1)：(0.1～2)：(0.1～1)：(0.1～20)：(0.1～1)：(0.1～10)。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合液中辅酶NADH的浓度为0.001～10.0mM；所述混合液中焦磷酸硫胺素TPP的浓度为0.001～10.0mM。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、乙醇胺缓冲液、双甘氨酸缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缓冲液浓度为20～100mM，优选为50mM。
10.根据权利要求4～9任一项所述的方法，其特征在于，所述多酶级联反应催化CO2合成乙醇的方法以CO2为底物；
...【技术特征摘要】
1.一种催化co2合成乙醇的多酶级联反应途径，所述途径包括：以co2为原料，首先通过甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶将co2活化为甲醛，然后通过自主构建的人工代谢途径将甲醛转化为乙酰辅酶a，再进一步通过乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶将乙酰辅酶a合成为乙醇。
2.根据权利要求1所述的多酶级联途径，其特征在于，所述多酶级联催化co2合成乙醇的途径包括利用甲酸脱氢酶和甲醛脱氢酶2种酶级联催化实现co2活化为甲醛，甲醛进入人工代谢途径，其中果糖-6-磷酸在磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶的作用下转化为乙酰辅酶a，乙酰辅酶a进一步在乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶2种酶级联催化作用下转化为乙醇；
3.根据权利要求2所述的人工代谢途径，其特征在于，首先甲醛结合核酮糖-5-磷酸在磷酸己酮糖合成酶的作用下转化为己酮糖-6-磷酸，然后己酮糖-6-磷酸在磷酸己酮糖异构酶的作用下转化为果糖-6-磷酸，进一步果糖-6-磷酸(一分子)在6-磷酸果糖磷酸转酮酶和磷酸乙酰转移酶的级联催化作用下转化为乙酰辅酶a，另一分子果糖-6-磷酸结合生成的赤藓糖-4-磷酸通过一系列涉及转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶和磷酸核酮糖差向异构酶的反应再生两分子核酮糖-5-磷酸完成循环反应；
4.一种多酶级联反应催化co2合成乙醇的方法，所述方法包括：将甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、磷酸己酮糖合成酶、磷酸己酮糖异构酶、6-磷酸果糖磷酸转酮酶、磷酸乙酰转移酶、转醛酶、转酮酶、磷酸核酮糖异构酶、磷酸核酮糖差向异构酶、乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶、辅酶nadh、焦磷酸硫胺素tpp、辅酶a、核糖-5-磷酸、无水硫酸镁和缓冲液混合，向混合液中通入co2进行催化反应，检测乙醇生成浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶为具有催化co2合成甲酸功能的相关酶；所述甲醛脱氢酶为具有催化甲酸合成甲醛功能的相关酶；所述磷酸己酮糖合成酶为具有催化甲醛和核酮糖-5-磷酸合成己酮糖-6-磷酸功能的相关酶；所述磷酸己酮糖异构酶为具有催化己酮...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉红，纪秀玲，董婉蓉，薛雅鞠，张锁江，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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