【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物法合成天然染料，尤其涉及一种合成观蓝的工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、观蓝(indigoidine)，是一种无毒副作用的天然蓝色素，主要应用于染料行业。观蓝在生物体内合成主要是由4′-磷酸泛酰疏基乙胺基转移酶活化观蓝合成酶，将生物体内的2分子谷氨酰胺合成为1分子观蓝。
2、色素可分为天然色素和合成色素，合成色素相对天然色素来说，具有色泽明亮鲜艳、种类丰富、生产产量高、成本及价格低廉的优点。但由于其合成过程所用原料大多是有毒化合物，大量使用不仅容易中毒、致癌、引起过敏，而且合成色素本身难以降解，工业废水毒性大、难降解、色度值高，引起严重的环境污染问题。因此微生物发酵生产蓝色素污染小、成本较低，已逐步成为工业合成色素的替代方案，但是目前行业内微生物发酵生产观蓝的产量较低，导致成本较高，离大规模工业生产应用还有一段距离。针对上述现有技术存在的问题，本专利技术公开了一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，其具有降低成本，提高效率，实现工业化应用的潜力。
技术实现思路
1、本申请的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种通过降低副产物合成、提高谷氨酰胺在体内的积累，从而提高观蓝产量的工程菌。
2、为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
3、第一方面，本申请提供了一种合成观蓝的工程菌，所述工程菌表达蓝色素合成酶bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp、谷氨酰胺合成酶glna*和谷氨酸脱氢酶gdh a；
4、所述工程菌敲除谷
5、所述合成观蓝的工程菌corynebacterium glutamicum保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为cctccno：m 2024243，保藏日期为2024年01月29日。
6、本申请通过敲除prob和acea基因，将对glna基因进行定点突变(y405f、y405n、y405l)并将glsk基因替换为glna*基因，将ldh基因替换为gdha基因，整合bpsa和sfp基因，能够阻断谷氨酸棒状杆菌中的丙酮酸转变为乳酸盐、异柠檬酸裂解为琥珀酸、谷氨酸转变为脯氨酸、谷氨酰胺水解为谷氨酸，提升了丙酮酸流向三羧酸循环和α-酮戊二酸流向谷氨酸的通量，使生物体内的谷氨酰胺浓度提高，促进了蓝色合成酶催化谷氨酰胺合成观蓝，从而提高观蓝的产量。
7、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述谷氨酰胺合成酶glna*由含有突变位点的谷氨酰胺合成酶glna编码得到，所述谷氨酰胺合成酶的编码序列如seq no.1所示，所述突变位点包括如下1)-3)中的任意一种：
8、1)第405位由酪氨酸突变为苯丙氨酸；
9、2)第405位由酪氨酸突变为天门冬酰胺；
10、3)第405位由酪氨酸突变为亮氨酸。
11、本申请通过对glna的第405位进行定点突变，再插入至敲除了glsk的位点上，能够促进谷氨酸转变为谷氨酰胺，提高谷氨酰胺的浓度。
12、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述蓝色素合成酶bpsa来源于淡紫灰链霉菌streptomyces lavendulae；所述蓝色素合成酶bpsa的编码序列如seq id no.2所示。
13、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp来源于枯草芽孢杆菌bacillus subtilis；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp的编码序列如seq id no.3所示。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transfe rase)是一种催化磷酸泛酰巯基乙胺基转移的酶，能够激活bpsa催化谷氨酰胺合成观蓝。
14、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述谷氨酸脱氢酶gdha来源于谷氨酸棒状杆菌；所述谷氨酸脱氢酶gdha的编码序列如seq id no.4所示。
15、第二方面，本申请提供了上述工程的构建方法，其包括以下步骤：
16、a1、利用基因编辑技术将谷氨酸棒状杆菌上的谷氨酰胺酶glsk编码基因替换为谷氨酰胺合成酶glna*编码基因，得到工程菌a；
17、a2、利用基因编辑技术将步骤a1所得工程菌a上的谷氨酸5-激酶prob编码基因敲除，得到工程菌b；
18、a3、利用基因编辑技术将步骤a2所得工程菌b上的异柠檬酸裂解酶acea编码基因敲除，得到工程菌c；
19、a4、利用基因编辑技术将步骤a3所得工程菌c上的乳酸脱氢酶ldh编码基因替换为谷氨酸脱氢酶gdha编码基因，得到工程菌d；
20、a5、利用基因编辑技术将蓝色素合成酶bpsa和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp的编码基因整合至步骤a4所得工程菌d中，得到工程菌e，所得工程菌e为合成观蓝的工程菌。
21、作为本申请所述构建方法的优选实施方式在步骤a5中所述蓝色素合成酶bpsa和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp的编码基因经密码子优化后整合至工程菌d中。
22、第三方面，本申请提供了上述工程菌在合成观蓝中应用。
23、第四方面，本申请提供了一种合成观蓝的方法，将上述工程菌的种子液与发酵培养基在生物反应器中发酵得到。
24、本申请提供了一种合成观蓝的方法，通过诱导工程菌cg07的以葡萄糖为底物通过一系列生物化学反应制备为观蓝。合成过程中所采用的工程菌cg07能够阻断谷氨酸棒状杆菌中的丙酮酸转变为乳酸盐、异柠檬酸裂解为琥珀酸、谷氨酸转变为脯氨酸、谷氨酰胺水解为谷氨酸，能够降低副产物形成的同时提高谷氨酰胺的水平，进一步促进α-酮戊二酸转变为谷氨酸、谷氨酸转变为谷氨酰胺，并活化蓝色素合成酶，使谷氨酰胺合成观蓝，所得观蓝的摇瓶发酵产量可达15.48g/l。
25、作为本申请所述方法的优选实施方式，所述发酵条件为在20℃、200rpm下发酵72-96h；
26、所述生物反应器中还含有终浓度为0.8-1.5mm的iptg溶液。
27、与现有技术相比，本申请的有益效果为：
28、(1)本申请通过敲除prob和acea基因，将对glna基因进行定点突变(y405f、y405n、y405l)并将glsk基因替换为glna*基因，将ldh基因替换为gdha基因，整合bpsa和sfp基因，能够阻断谷氨酸棒状杆菌中的丙酮酸转变为乳酸盐、异柠檬酸裂解为琥珀酸、谷氨酸转变为脯氨酸、谷氨酰胺水解为谷氨酸，提升了丙酮酸流向三羧酸循环和α-酮戊二酸流向谷氨酸的通量，使生物体内的谷氨酰胺浓度提高，促进了蓝色合成酶催化谷氨酰胺合成观蓝，从而提高观蓝的产量。
29、(2)本申请提供了一种合成观蓝的方法，通过诱导工程菌cg07的以葡萄糖为底物通过一系列生物化学反应制备为观蓝。合成过程中所采用的工程菌cg07能够阻断谷氨酸棒状杆菌中的丙酮酸转变为乳酸盐、异柠檬酸裂解为琥珀酸、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成观蓝的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达蓝色素合成酶bpsA、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp、谷氨酰胺合成酶glnA*和谷氨酸脱氢酶gdhA；
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶glnA*由含有突变位点的谷氨酰胺合成酶glnA编码得到所述谷氨酰胺合成酶的编码序列如SEQ NO.1所示，所述突变位点包括如下1)-3)中的任意一种：
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述蓝色素合成酶bpsA来源于淡紫灰链霉菌Streptomyces lavendulae；所述蓝色素合成酶bpsA的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶gdhA来源于谷氨酸棒状杆菌；所述谷氨酸脱氢酶gdhA的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
6.如
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在步骤A5中，所述蓝色素合成酶bpsA和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp的编码基因经密码子优化后整合至工程菌D中。
8.如权利要求1-5任一项所述工程菌在合成观蓝中应用。
9.一种合成观蓝的方法，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述工程菌的种子液与发酵培养基在生物反应器中发酵得到。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为在20℃、200rpm下发酵72-96h；
...【技术特征摘要】
1.一种合成观蓝的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达蓝色素合成酶bpsa、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp、谷氨酰胺合成酶glna*和谷氨酸脱氢酶gdha；
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶glna*由含有突变位点的谷氨酰胺合成酶glna编码得到所述谷氨酰胺合成酶的编码序列如seq no.1所示，所述突变位点包括如下1)-3)中的任意一种：
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述蓝色素合成酶bpsa来源于淡紫灰链霉菌streptomyces lavendulae；所述蓝色素合成酶bpsa的编码序列如seq id no.2所示。
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp来源于枯草芽孢杆菌bacillus subtilis；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp的...
【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，
申请(专利权)人：南京合谷生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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