【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，更具体的说是一种检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa方法及其应用。
技术介绍
1、马立克氏病(marek＇s disease，md)是我国家禽三大主要传染病之一，能引起鸡发生急性t细胞淋巴瘤，破坏免疫器官的结构和功能，以外周神经、皮肤和虹膜在内的各种器官和组织的单核性细胞浸润为特征，能在多个器官上形成肿瘤或造成器官的明显肿大。严重抑制鸡群对疫苗的反应，加剧其它病原的感染风险。马立克氏病病毒(mdv)属于高致瘤性疱疹病毒，引起被感染鸡的免疫抑制和肿瘤发生，主要诱发淋巴细胞瘤。
2、目前，诊断马立克病(md)的经典方法包括病毒分离、组织病理学观察以及pcr、lamp等技术，然而这些方法都存在一些局限性。病毒分离需要在特定的实验条件下操作，包括特定的细胞培养、病毒培养液和特殊的实验室设施等。这些限制条件可能导致分离的成功率较低，从而影响诊断结果的准确性。利用组织病理学观察诊断md，可能需要进行有创的手术或活检程序。对于某些患禽来说，这可能是不切实际的，特别是在病情严重或手术风险较高的情况下。此外，病理判断是基于病理学家对组织切片的观察和解释，不同的病理学家可能会对相同的切片进行不同的解读，导致诊断的不一致性或主观性。pcr诊断md，涉及核酸扩增，但马立克病涉及多个组织和器官，不同组织中的核酸含量和质量可能存在差异。因此，在选择适当的样本进行pcr分析时，确保核酸提取的纯度和完整性是具有挑战性的。在pcr诊断中，常常需要选择间接指示的标志物，如：β-actin、gapdh(糖酵解磷酸化脱氢酶
3、酶联免疫吸附试验(elisa)是以免疫学为基础将抗原抗体的特异性反应和酶对底物的高效催化作用相结合的一种血清学技术。目前广泛用于生物学和医学的研究领域。但是目前用于md的elisa方法较为粗糙，有研究用感染马立克病病毒的细胞铺板，用其作为抗原去捕捉抗体；还有一些商品化的试剂盒可用于检测mdv的抗体，但是这些抗体是混合抗体，不能和它的保护效果相关联，不具有针对性。:马立克氏病病毒(mdv)糖蛋白c(gc)是参与mdv水平传播的毒力因子，但其具体作用机制尚未明确，且现有技术也未见将gc蛋白作为md鉴别间接指示标记物的相关研究。
4、因此，如何提供一种更具有针对性，操作简单快捷，特异性高，重复性好的马立克氏病病毒gc蛋白抗体间接elisa检测方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa方法及其应用，方法中选取糖蛋白c基因编码的第69-85位氨基酸区段的gc抗原肽段，作为包被抗原，通过检测对象的血清中gc蛋白的抗体的有无，进而判断定性检测md，且本专利技术方法采用化学方法直接合成包被抗原，相比于传统的原核表达需要表达一段蛋白或整个完整的蛋白，本专利技术的化学合成肽既不具有修饰性，且产量具有可控性，极大的缩短了抗原制备时间，提高了稳定性强。另一方面，相比于传统的pcr鉴别方法，无需提取样本dna，操作简便快捷，2h内就可以完成检测，具有较高的重复性和特异性。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa方法及其应用，以马立克病毒编辑糖蛋白c的基因序列为模板，编码其对应的氨基酸序列，选取序列中第69-85位氨基酸区段的gc抗原肽，作为包被抗原，建立检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa检测方法。
4、上述操作的有益效果：本专利技术间接elisa方法根据待测血清中gc抗体的表达量用于定性鉴别md，整套方法用于诊断md需要2h，优于pcr技术鉴定md，并且本专利技术是首次提出用gc蛋白作为包被抗原的间接elisa方法，为临床检测md提供了技术指导。
5、优选的，所述检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa检测方法，具体步骤如下：
6、(1)以马立克病毒编辑糖蛋白c的基因序列为模板，编码其对应的氨基酸序列，选取序列中第69-85位氨基酸区段的gc抗原肽，作为包被抗原；
7、(2)将包被抗原放入elisa板中进行包被，洗涤，得包被板；
8、(3)取步骤(2)包被板，加入封闭液，封闭、洗涤，得封闭板；
9、(4)加入稀释好的一抗进行孵育，并设立阴性对照，孵育后洗涤，加入二抗进行孵育；
10、(5)二抗孵育结束后，洗涤，加入tmb显色液显色，加入显色终止液，终止反应；
11、(6)利用酶标仪测定步骤(5)elisa板中液体od450nm值，当od450值≥0.270抗体检测为阳性，od450值＜0.270抗体检测为阴性。
12、优选的，步骤(2)所述包被条件为：37℃湿盒孵育2h后，4℃包被过夜；所述包被抗原的浓度为7.5μg/ml。
13、优选的，步骤(3)所述封闭条件为37℃湿盒孵育2h。
14、优选的，步骤(4)一抗为稀释倍数为稀释倍数为1:400的待检测血清，孵育条件为37℃湿盒孵育1h；二抗为稀释倍数为1:5000的hrp山羊抗鸡igg抗体，孵育条件为37℃湿盒孵育45min。
15、优选的，步骤(5)显色的条件为37℃孵育15min。
16、本专利技术的另一目的在于提供上述间接elisa方法在马立克氏病病毒检测中的应用。
17、本专利技术的另一目的在于提供一种检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa试剂盒，包括上述gc抗原肽、阴性对照包被的elisa板、hrp标记的山羊抗鸡igg抗体和辅助试剂。
18、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
19、(1)现有技术针对md的定性鉴别，通常采用pcr或者是免疫荧光的方法检测mdv抗原的核酸或蛋白，但马立克病涉及多个组织和器官，不同组织中的核酸含量和质量可能存在差异，且提取过程要确保核酸提取的纯度和完整性，挑战性极大；而蛋白提取都是采用传统的原核表达，过程繁琐，且原核表达过程中培养基条件要求高。本专利技术选取糖蛋白c基因编码的第69-85位氨基酸区段的gc抗原肽段，作为包被抗原，通过检测对象的血清中gc蛋白的抗体的有无，就可以定性检测md，且本专利技术方法采用化学方法直接合成包被抗原，相比于传统的原核表达需要表达一段蛋白或整个完整的蛋白，本专利技术的化学合成肽既不具有修饰性，且产量具有可控性，极大的缩短了抗原制备时间，提高了稳定性强。另一方面，相比于传统的pcr鉴别方法，无需提取样本dna，操作简便快捷，2h内就可以完成检测，具有较高的重复性和特异性。
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1.一种检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA方法，其特征在于，以马立克病毒编辑糖蛋白C的基因序列为模板，编码其对应的氨基酸序列，选取序列中第69-85位氨基酸区段的gC抗原肽，作为包被抗原，建立检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA检测方法。
2.根据权利要求1所述的检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(2)所述包被条件为：37℃湿盒孵育2h后，4℃包被过夜；所述包被抗原的浓度为7.5μg/mL。
4.根据权利要求3所述的检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(3)所述封闭条件为37℃湿盒孵育2h。
5.根据权利要求4所述的检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(4)一抗为稀释倍数1:400的待检测血清，孵育条件为37℃湿盒孵育1h；二抗为稀释倍数为1:5000的HRP山羊抗鸡IgG抗体，孵育条件为37℃湿
6.根据权利要求5所述的检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(5)显色的条件为37℃孵育15min。
7.根据权利要求1-6任一所述的间接ELISA方法在马立克氏病病毒检测中的应用。
8.一种检测马立克氏病病毒gC蛋白抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的gC抗原肽、阴性对照包被的ELISA板、HRP标记的山羊抗鸡IgG和辅助试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa方法，其特征在于，以马立克病毒编辑糖蛋白c的基因序列为模板，编码其对应的氨基酸序列，选取序列中第69-85位氨基酸区段的gc抗原肽，作为包被抗原，建立检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa检测方法。
2.根据权利要求1所述的检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa检测方法，其特征在于，步骤(2)所述包被条件为：37℃湿盒孵育2h后，4℃包被过夜；所述包被抗原的浓度为7.5μg/ml。
4.根据权利要求3所述的检测马立克氏病病毒gc蛋白抗体的间接elisa检测方法，其特征在于，步骤(3)所述封闭条件为37℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄腾，秦可，徐贝贝，梁佳华，李娟，梁开钧，滕卓敏，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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