一种检测活病毒滴度的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测活病毒滴度的方法，包括：（１）将稀释的待检病毒感染二倍体细胞或其他贴壁细胞，培养、固定；（２）向固定的细胞中加入病毒抗血清（一抗），培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的二抗，培养后洗涤，加入显色液显色，产生红色或褐色斑点；或者向固定的细胞中加入ＨＲＰ标记的病毒抗血清，培养后洗涤，加入显色液显色，产生红色或褐色斑点；（３）根据红色或褐色斑点数和稀释倍数计算病毒滴度；或者根据稀释度和产生斑点孔数，计算病毒的１ｇＴＣＩＤ５０值。本发明专利技术检测方法可适用于各种活病毒滴度的检测，检测速度快，可缩短病毒滴度检测时间；特异性好，免疫斑点是特异免疫反应所致；不需光学或荧光显微镜等专业仪器设备和其他试剂，检测成本低，操作简便。

Method for detecting live virus titer

The invention discloses a method, a live virus titer detection include: (1) the dilution of the detected virus infection or other diploid cell adherent cells, cultured, fixed; (2) adding to the fixed cell virus antiserum (anti), training, washing, adding horseradish peroxidase (HRP) labeled two antibody, cultured after washing, adding color liquid color, red or brown spots; virus antiserum or to fixed cells with HRP markers, cultured after washing, adding color liquid color, red or brown spots; (3) the virus titer was calculated according to the number of red or brown spots and dilution; or according to the dilution and produce spot hole numbers, computer virus 1gTCID50. The detecting method of the invention can be applicable to the detection of various live virus titer, fast detection speed, can shorten the time of virus titer; immune specificity, the spots are caused by specific immune response; without any optical or fluorescent microscope and other professional equipment and other reagents, detection of low cost, simple operation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤其涉及一种采用酶联免疫斑点方法 检测活病毒滴度的方法，属于生物制药领域。
技术介绍
迄今为止，对于活病毒滴度的检测方法主要包括蚀斑法，终点稀释法和酶联免疫荧光法等三种，三种检测方法的主要检测过程及优缺点如下蚀斑法该方法是测定病毒滴度最经典的方法， 一般而言，1个蚀斑是由1个 病毒粒子产生的，以蚀斑形成单位(PFU)表示。以水痘病毒为例，培养瓶内生长 状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到6孔细胞培养板，37。C5。/。C02培养箱培养到 细胞形成单层进行试验。弃去培养液，加入合适稀释的水痘病毒，100ul/孔； 37。C5。/。C02培养箱吸附，每20分钟摇勾一次，吸附40分钟；补加病毒培养液，3ml/ 孔，37。C5。/。CO2培养箱培养8-10天；弃去病毒培养液，加入考马斯亮蓝染液，lml/ 孔，染色10分钟；弃去染液，计蚀斑数，病毒滴度H:虫斑数x稀释倍数xlO(PFU/ml)。 该方法存在几个方面的缺陷1、检测时间长， 一般需要8-10天；2、准确性不高， 病毒感染细胞培养到8-10天，相邻的蚀斑可能联合到一起，降低了病毒滴度，也可 能母斑病毒产生子斑，增加了病毒滴度，即导致试—验重复性差；3、蚀斑只有数目 多少，没有特异性表征，因而不能反映蚀斑是否由水痘病毒感染细胞引发的病变所 致。终点稀释法以50。/。组织培养剂量(TCID5。)表示，TCID5o是指能使半数单层细 胞孔(管)出现病变的病毒稀释度。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS 或MRC-5细胞传代到96孔细胞培养板，37。C5。/。C02培养箱培养到细胞形成单层进 行试验。取水痘病毒悬液，用病毒稀释液按10倍系列稀释(10-10-;稀释的病毒 悬液加入到形成单层的组织培养细胞中，每稀释度感染4-12孑L细胞，50ul/孔； 37。C5。/。C02培养箱吸附40分钟；补加病毒培养液，50ul/孔，37。C5。/。C02培养箱培 养8-10天；显微观察并记录每稀释度每孔细胞有无病变，记录的数据按Reed-Muench法或Karber计算病毒TCID5o值。该方法所存在的缺陷同蚀斑法一样，需要的时间 长；结果观察需要显凝:操作，比较繁瑣；也不能反映病斑的特异性。酶联免疫荧光法该方法的细胞培养、病毒感染培养同蚀斑法或终点稀释法。 以96孔板为例，感染细胞培养24-48小时，弃去病毒维持液后，每孔加2%甲醛溶液 100ul固定已感染的2BS细胞或MRC-5细胞；IO分钟后，弃去曱醛溶液，用200ul PBS 洗3次，2分钟/次；加50ulPBS稀释的l %牛血清白蛋白(BSA)到每个孔内孵育l小时； 弃去BSA液，立即加入30ul人抗VZV血清，室温孵育l小时；用200ulPBS洗4次，2 分钟/次；加入荧光素标记的羊抗人抗体，室温孵育l小时，然后用200ulPBS洗5 次，2分钟/次；用装有CCD相机100X萸光显微镜观察每个孔的焚光灶，计数，荧 光灶是由于感染所引起的；观察每孔中荧光灶数目，确定感染是否阳性；按标准方 法计算病毒滴度(TCID5Q)。该方法优点是检测所需的时间短，能反映病毒的特异 性，但是，需要荧光显微镜，操作者需要专业经验，不同操作者之间测得结果相差 较大。总之，目前尚缺乏一种快速、准确、特异性高、检测成本低的活病毒滴度的 检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的检测病毒滴 度的方法，该方法不仅快速，而且可以反映检测的特异性。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种检测病毒滴度的方法，包括(1) 将一步稀释或系列稀释的待检病毒感染贴壁细胞、培养后，用固定剂固 定细胞；(2) 向已固定的细胞中加入病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入辣 才艮过氧化物酶标记的二抗，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；或者向已固定 的细胞中加入辣根过氧化物酶标记的病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入 显色剂显色，产生红色或褐色斑点；(3) 根据以下公式计算病毒滴度病毒滴度-红色或褐色斑点均数x待检测病 毒的稀释倍数+待检测病毒感染贴壁细胞的剂量(毫升)；或者根据稀释度和产生红 色或褐色斑点的孔数，计算病毒的lgTCID50值。上述检测方法中，步骤(1 )中所述的贴壁细胞优选自MRC-5细胞，2BS细胞、Vero细胞等贴壁细胞；步骤(1)中所述的培养优选为 在以下条件进行细胞培养培养温度为37°C,在5。/。C02培养箱中培养形成单层； 步骤(1)中所述的固定剂优选自曱醛、甲醇、乙醇-乙酸、戊二醛或丙酮中的任意 一种或一种以上按任意比例所组成的混合物。步骤(2 )中所述的培养优选为在以下条件下进行细胞培养培养温度25~37°C ， 培养时间为20-90分钟(更优选为30-60分钟)；所述的显色剂可以是3-氨基-9-乙基 一^唑(AEC)、 二氨基联苯胺(DAB)等能被氧化生成不溶性沉淀物的HRP底物， 优选为AEC;所述的酶标记的二抗优选为辣4艮过氧化物酶标记的二抗。本专利技术利用了AEC、 DAB等显色剂可被HRP催化生成不溶性沉淀的原理，采 用免疫斑点的方法4企测活病毒滴度，免疫沉淀的红色或褐色斑点都为待检病毒感染 增殖所为，所染成的红色或褐色的斑点皆为待检病毒所特异的病斑。本专利技术方法可适用于检测各种活病毒的滴度，用蚀斑法、终点稀释法或免疫荧 光法检测滴度的病毒都可适用于本专利技术的方法检测其病毒滴度，例如，采用本专利技术 方法可以检测甲肝病毒、狂犬病毒、风渗病毒、麻渗病毒、乙脑病毒、水痘-带状疱 渗病毒或SARS病毒等各种常见病毒的滴度。本专利技术方法与现有的病毒滴度检测方法相比，主要具有以下几方面的优点1、 检测速度快，可以缩短细胞病变的培养时间，如水痘病毒滴度的蚀斑法枱r 测细胞病变需要培养8~10天，用该方法检测细胞病变只需要培养3天。2、 特异性好，免疫斑点是特异免疫反应结果，染成红/褐色的斑点皆为待检病 毒所特异的病斑；3、 检测成本低，不需光学或荧光显微镜等专业仪器设备和其他试剂，不需要 专业人士操作；4、 4喿作简^更、快速。附图说明图1 采用本专利技术酶联免疫斑点法检测水痘-带状疱渗病毒滴度的显色结果； 图2采用蚀斑法检测水痘-带状疱渗病毒滴度，细胞用考马斯兰染色的显色结果。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些^l改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 试验材料(1 )细胞基质二倍体细胞，如MRC-5细胞、WI-38细胞、Vero细胞(购自 ATCC), 2BS细胞，KMB17 (中科院昆明研究所)；(2) 细胞培养液MEM，含0.03%谷氨酰胺、0.17%碳酸氢钠和10%牛血清；(3) 病毒维持液MEM，含0.03%谷氨酰胺、0.24%碳酸氢钠和5°/。牛血清；(4) 固定液甲醛、甲醇、乙醇-乙酸、戊二醛或丙酮；(5) 水痘-带状疱渗病毒抗血清(自制，水痘病毒抗体阳性血清，且乙肝、丙 肝和艾滋病毒阴性的血清，在60。C灭本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测病毒滴度的方法，包括：　（１）将稀释的待检病毒感染贴壁细胞、培养后，用固定剂固定细胞；　（２）向已固定的细胞中加入病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；或者 向固定的细胞中加入辣根过氧化物酶标记的病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；　（３）根据以下公式计算病毒滴度：病毒滴度＝红色或褐色斑点均数×待检测病毒的稀释倍数÷待检测病毒感染贴壁细胞的剂量，待检测病 毒感染贴壁细胞的剂量单位为毫升；或者根据稀释度和产生斑点的孔数，计算病毒的１ｇＴＣＩＤ５０值。

【技术特征摘要】
1、一种检测病毒滴度的方法，包括(1)将稀释的待检病毒感染贴壁细胞、培养后，用固定剂固定细胞；(2)向已固定的细胞中加入病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；或者向固定的细胞中加入辣根过氧化物酶标记的病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；(3)根据以下公式计算病毒滴度病毒滴度＝红色或褐色斑点均数×待检测病毒的稀释倍数÷待检测病毒感染贴壁细胞的剂量，待检测病毒感染贴壁细胞的剂量单位为毫升；或者根据稀释度和产生斑点的孔数，计算病毒的1gTCID50值。2、 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤(1)中所述的贴壁细胞选自 MRC-5, 2BS、 WI陽38、 KMB17或Vero细月包。3、 按照权利要求1的方法，其特征在于步骤(1 )中所述的培养是在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李益民，叶祥忠，
申请(专利权)人：北京万泰生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]