【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子育种领域，具体涉及水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物a-to-k单碱基编辑中的应用，特别涉及基于水稻烷基嘌呤糖基化酶osmpg及其突变体mosmpg开发的新型植物a-to-k的单碱基编辑器rakbes，以及利用rakbes同时实现植物基因组中靶序列编辑窗口内腺嘌呤(a)的转换(g)和颠换(t)的方法。
技术介绍
1、遗传变异是作物性状遗传改良的基础，植物育种的目标是通过利用更多的遗传变异，提高农作物的产量、品质、抗病性等，从而创制农艺性状优良的农作物新种质。在农作物品种演化过程中，等位基因的差异是造成农作物产量和其他重要农艺性状差异的主要原因，而等位基因的差异通常是由一个或多个单核苷酸多态性(snp)的差异或特定片段的插入/缺失引起的。利用常规育种方法将优异等位基因导入栽培品种往往需要经过多次杂交和回交，通常需要数年时间，耗时费力。此外，针对重要农艺性状关键基因创制新型等位变异，可以丰富农作物的遗传多样性，从而满足育种实践中的多样化需求。crispr/cas介导的碱基编辑可在靶位点实现单个碱基的转换或颠换，利用单碱基编辑技术介导的内源靶标基因定向进化，可在短时间内创制数百个新的等位变异，极大促进了基因功能研究和农作物改良。目前，农作物中常用的单碱基编辑系统主要有两大类：胞嘧啶碱基编辑系统(cbe)和腺嘌呤碱基编辑系统(abe)。cbe系统主要由ncas9(d10a)、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶-dna糖基化酶抑制剂(ugi)融合而成，其在编辑窗口内可实现c-to-t的单碱基转换；abe系统主要由ncas9(d10a
2、近期，tong等人通过将腺嘌呤碱基编辑器与人源烷基嘌呤糖基化酶(hmpg)融合，开发了一种新型碱基编辑器aybe，其可在动物细胞系中成功介导a-to-y(y＝c/t)的碱基颠换。chen等人通过将tada8e与小鼠来源的烷基嘌呤糖基化酶(mmpg或maag)融合，成功开发了两种新型腺嘌呤颠换编辑工具axbes和acbes，均可在动物细胞系中实现高效的a-to-c碱基颠换。以上结果表明，不同来源的mpg可能具有不同的碱基切除修复活性。同时，li等人和wu等人通过将水稻密码子优化的hmpg或其突变体mhmpg与abe8e或abe-tada9融合，获得了植物单碱基编辑器pakbes。但是，在水稻植株中，akbe仅可在编辑窗口内实现a-to-g/t的碱基编辑，很少或无法检测到a-to-c的碱基颠换。由此看来，利用不同的来源的mpg，对于针对不同的应用场景开发不同的腺嘌呤碱基编辑器具有重要意义。类似于人和小鼠来源的mpg，在水稻中同样存在着mpg同源蛋白，但水稻mpg(osmpg)的功能未知，是否可用于开发植物碱基编辑器，进而实现植物中精准的a-to-g/c/t碱基编辑，需要进一步探究。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是如何在植物中高效实现a-to-g/c/t碱基编辑。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了成套系统。
3、本专利技术提供的成套系统为如下m1)-m4)中任一种：
4、m1)所述成套系统包括腺嘌呤脱氨酶tada8e、cas9(d10a)缺刻酶、水稻烷基dna糖基化酶osmpg和grna；
5、m2)所述成套系统包括腺嘌呤脱氨酶tada8e、cas9(d10a)缺刻酶、水稻烷基dna糖基化酶突变体mosmpg和grna；
6、m3)所述成套系统包括反式激活因子vp64、腺嘌呤脱氨酶tada8e、cas9(d10a)缺刻酶、水稻烷基dna糖基化酶osmpg和grna；
7、m4)所述成套系统包括反式激活因子vp64、腺嘌呤脱氨酶tada8e、cas9(d10a)缺刻酶、水稻烷基dna糖基化酶突变体mosmpg和grna；
8、所述水稻烷基dna糖基化酶突变体mosmpg为将所述水稻烷基dna糖基化酶osmpg氨基酸序列的第162位由甘氨酸突变为精氨酸，且将第168位由天冬酰胺突变为丝氨酸后得到的蛋白质。
9、上述成套系统中，所述腺嘌呤脱氨酶tada8e为a1)或a2)：
10、a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
11、a2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
12、所述腺嘌呤脱氨酶tada8e的编码基因为a1)或a2)：
13、a1)序列1第2591-3088位所示的dna分子；
14、a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述腺嘌呤脱氨酶tada8e的dna分子。
15、所述cas9(d10a)缺刻酶为b1)或b2)：
16、b1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
17、b2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
18、所述cas9(d10a)缺刻酶的编码基因为b1)或b2)：
19、b1)序列1第3185-7285位所示的dna分子；
20、b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述cas9(d10a)缺刻酶的dna分子。
21、所述水稻烷基dna糖基化酶osmpg为c1)或c2)：
22、c1)氨基酸序列是序列8所示的蛋白质；
23、c2)将序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
24、所述水稻烷基dna糖基化酶osmpg的编码基因为c1)或c2)：
25、c1)序列7所示的dna分子；
26、c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述水稻烷基dna糖基化酶osmpg的dna分子。
27、所述反式激活因子vp64为d1)或d2)：
28、d1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
29、d2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
30、所述反式激活因子vp64的编码基因为d1)或d2)：
31、d1)序列5第1-150位所示的dna分子；
32、d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.成套系统，所述成套系统为如下M1)-M4)中任一种：
2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e为A1)或A2)：
3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9(D10A)缺刻酶为B1)或B2)：
4.根据权利要求1-3任一所述的成套系统，其特征在于：所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG为C1)或C2)：
5.根据权利要求1-4任一所述的成套系统，其特征在于：所述反式激活因子Vp64为D1)或D2)：
6.根据权利要求1-5任一所述的成套系统，其特征在于：所述成套系统还包括筛选剂抗性蛋白；
7.权利要求1-6任一所述的成套系统在如下S1)-S9)任一种中的应用：
8.如下T1)-T4)任一所述的方法：
9.根据权利要求1-6任一所述的成套系统或权利要求7所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物基因组序列的编辑包括将植物基因组序列中的碱基A突变为碱基C和/或碱基A突变为碱基G和/或碱基A突变为碱基T。
10.
...【技术特征摘要】
1.成套系统，所述成套系统为如下m1)-m4)中任一种：
2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述腺嘌呤脱氨酶tada8e为a1)或a2)：
3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述cas9(d10a)缺刻酶为b1)或b2)：
4.根据权利要求1-3任一所述的成套系统，其特征在于：所述水稻烷基dna糖基化酶osmpg为c1)或c2)：
5.根据权利要求1-4任一所述的成套系统，其特征在于：所述反式激活因子vp64为d1)或d2)：
6.根据权利要求1-5任一所述的成套系统，...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，李玉才，李少雅，林勇，张阳军，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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