【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物代谢工程，尤其涉及一种基于丙二酰辅酶a再生途径的高产金霉素工程菌株。
技术介绍
1、金霉素（chlorotetracycline, ctc）由金色链霉菌（ kitasatospora aureofaciens）发酵产生，是一类临床上主要用于治疗革兰氏阳性球菌的四环类广谱抗生素。此外，它还能抑制立克次氏体、沙眼病毒及淋巴肉芽肿病毒，因此，金霉素在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途。但是金霉素发酵属于高能耗、高成本产业，且发酵周期长，而通过传统的优化发酵条件等方法提高金霉素产量的范围有限，因此需要对金色链霉菌工程菌株进行合理优化。
2、活性天然产物的合成是一系列酶促反应的结果，而影响酶促反应速率的因素包括底物浓度、ph、温度、酶浓度等。因此在适宜温度、适宜ph等菌株的发酵条件下，底物浓度成为影响活性天然产物产量的重要因素之一。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于丙二酰辅酶a再生途径的高产金霉素工程菌株。
2、为解决上述问题，本专利技术所述的一种基于丙二酰辅酶a再生途径的高产金霉素工程菌株，其特征在于：该金霉素工程菌株为 kitasatospora aureofaciensyz-7，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmcc no. 29435（保藏单位地址：中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号
3、如上所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
4、⑴构建丙二酰辅酶a再生载体：
5、①构建引物seq1、seq2、seq3、seq4；
6、seq1为具有序列表中seq id no.1第1位到36位所示的核苷酸序列；
7、seq2为具有序列表中seq id no.1第2位到28位所示的核苷酸序列；
8、seq3为具有序列表中seq id no.3第1位到30位所示的核苷酸序列；
9、seq4为具有序列表中seq id no.4第1位到41位所示的核苷酸序列；
10、seq1的下划线为ecorv的酶切位点，seq4的下划线为xbai的酶切位点；
11、②获取目的基因：
12、以菌株 streptomyces venezuelaeatcc 10712的基因组dna为模板，seq1和seq2所示序列为引物对jadj基因进行pcr扩增，扩增出片段核苷酸序列seq5，seq5具有序列表中seq id no.5第1位到1841位所示的核苷酸序列，其中57-1810位为jadj的编码基因；
13、同时在jadj序列的前端插入erme启动子序列；
14、③构建jadj-psh152载体：
15、使用限制性内切酶ecorv和xbai对psh152质粒进行双酶切，随后将seq5与之相连，即得jadj-psh152载体；
16、⑵质粒转化：
17、大肠杆菌转化：
18、ⅰ取jadj-psh152载体10μl加入大肠杆菌et12567感受态中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴5min，加入lb液体培养基孵育1h后，在含有潮霉素的培养基上培养；
19、ⅱ金色链霉菌转化：
20、将金色链霉菌菌株在麦麸培养基培养至孢子成熟；然后取0.5ml用0.05m三羟甲基甲胺基乙磺酸缓冲液（tes buffer）制成孢子悬液，并置于50℃热激10min，随后加0.5ml的2×yt培养基30℃孵育2h，用0.5ml的lb液体培养基重悬；
21、将含有jadj-psh152载体的大肠杆菌et12567与重悬后的孢子悬液在30℃混合30min，涂布于含10mm mgcl2的麦麸培养基上，吹干后置于30℃培养箱中培养16h，用1ml含有50ng萘啶酮酸和50ng潮霉素的无菌水覆盖平板，吹干后置于30℃培养箱中培养5~8天后挑选接合子单克隆，该单克隆即为金霉素工程菌株。
22、所述步骤⑵中lb液体培养基是指在1l去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，混合均匀后调ph至中性，于5psi高压下蒸汽灭菌21min即得。
23、所述步骤⑵中金色链霉菌菌株为 kitasatospora aureofaciensyz，其从土壤中分离得到；所述 kitasatospora aureofaciensyz在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmcc no.29428（保藏单位地址：中国.北京. 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年12月28日）。
24、所述步骤⑵中麦麸培养基是指在1l去离子水中加入麦麸20g、磷酸氢二铵0.15g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.05g、琼脂20g，混合均匀后调ph至中性，于5psi高压下蒸汽灭菌21min即得。
25、所述步骤⑵中2×yt培养基是指在1l去离子水中加入胰蛋白胨16g、酵母提取物10g、氯化钠5g，混合均匀后调ph至中性，于5psi高压下蒸汽灭菌21min即得。
26、本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
27、1、本专利技术基于代谢工程，将链霉菌来源的乙酰辅酶a羧化酶jadj导入从土壤中分离得到的天然高产金色链霉菌菌株中，高产金霉素底物丙二酰辅酶a，构建金霉素生产工程菌。
28、2、本专利技术所述工程菌较目前金霉素生产菌株产量提高，发酵周期缩短。
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1.一种基于丙二酰辅酶A再生途径的高产金霉素工程菌株，其特征在于：该金霉素工程菌株为Kitasatospora aureofaciens YZ-7，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No. 29435。
2.如权利要求1所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中LB液体培养基是指在1L去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，混合均匀后调pH至中性，于5psi高压下蒸汽灭菌21min即得。
4.如权利要求2所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中金色链霉菌菌株为Kitasatospora aureofaciens YZ，其从土壤中分离得到；所述Kitasatospora aureofaciens YZ在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.29428。
5.如权利要求2所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中麦麸培养基是指在1L去离子水中加入麦麸2
6.如权利要求2所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中2×YT培养基是指在1L去离子水中加入胰蛋白胨16g、酵母提取物10g、氯化钠5g，混合均匀后调pH至中性，于5psi高压下蒸汽灭菌21min即得。
...【技术特征摘要】
1.一种基于丙二酰辅酶a再生途径的高产金霉素工程菌株，其特征在于：该金霉素工程菌株为kitasatospora aureofaciens yz-7，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmcc no. 29435。
2.如权利要求1所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中lb液体培养基是指在1l去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，混合均匀后调ph至中性，于5psi高压下蒸汽灭菌21min即得。
4.如权利要求2所述的高产金霉素工程菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中金色链霉菌菌株为kitasatospora aureof...
【专利技术属性】
技术研发人员：武师宇，陈熙明，张威，陈拓，刘光琇，张昺林，吴玉洁，
申请(专利权)人：中国科学院西北生态环境资源研究院，
类型：发明
国别省市：
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