水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法技术

一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法，试纸条包括：基板（１）、吸附有胶体金标记的水泡性口炎病毒的单克隆抗体的样品吸收垫（２）、设有检测线（４）和对照线（５）的硝酸纤维膜（３）及吸水垫（６），且所述吸收垫（２）、硝酸纤维膜（３）及吸水垫（６）沿基板（１）的长度方向依次设置在基板（１）板面上。制作方法包括ａ．制备水泡性口炎病毒单克隆抗体；ｂ．烧制胶体金，并准备待标记单抗；ｃ．对抗体进行胶体金标记和纯化；ｄ．将纯化的胶体金标记抗体吸附于多孔纤维样品吸收垫上；ｅ．在硝酸纤维膜上形成由水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质Ａ包被或喷附的检测线和对照线；ｆ．将样品吸收垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次设置在基板板面上，形成检测试纸条。本发明专利技术无须使用特殊的设备和专门的技术人员，即可直接、快速对水泡性口炎病毒抗原做出检测。

Test paper for rapid detection of vesicular stomatitis virus and method for making the same

Rapid test strip and manufacturing method of a vesicular stomatitis virus test strip includes a substrate (1), adsorption of monoclonal antibody colloidal gold labeled vesicular stomatitis virus samples (2), the absorption pad is provided with a detection line (4) and the control line (5) of the nitrocellulose membrane (3) and the absorbent pad (6), and the absorption pad (2), nitrocellulose membrane (3) and (6) the absorbent pad along the substrate (1) in the longitudinal direction are arranged on a substrate (1) surface. The preparation method comprises the preparation of A. monoclonal antibody against vesicular stomatitis virus; B. by colloidal gold, and prepare to be labeled monoclonal antibody; C. antibody colloidal gold labeling and purification; D. colloidal gold labeled monoclonal antibody purified adsorbed on the porous fiber sample absorption pad; e. line detection by vesicular stomatitis polyclonal antibody and protein A coated or sprayed with and control lines are formed on the nitrocellulose membrane; F. sample absorption pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad are arranged on the surface of the base board, forming a test strip. The invention can detect the vesicular stomatitis virus directly and rapidly without the use of special equipment and special technical personnel.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于检测水泡性口炎病毒 抗原的快速^f全测试纸条及其制作方法。背景纟支术水泡性口炎是由弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus, VSV)引起的人畜共患的重大动物疫病。其包括印第安 纳(Indiana, IN型)和新泽西(New Jersey, NJ型)两个血清型。牛、 猪、马、羊和其它多种野生动物可感染，人感染后出现类似流感和登革热 的症状。临床症状与口蹄疫(FMD)不易区别，该病的存在及流行直接影响 人类及动物健康。水泡性口炎病毒的基因组编码包含N, NS， M, G， L等5 种病毒蛋白，其中，N蛋白是该病毒核衣壳的主要蛋白，为VSV的群特异性 抗原。1950年证实此病为人畜共患病。目前，水泡性口炎病毒最常用的诊 断方法包括病毒分离鉴定、病毒中和试验(VN)、补体结合试验(CF)、液 相阻断ELISA (LP-ELISA)、竟争酶联免疫吸附试验(c-ELISA )、反转录聚 合酶链反应(RT-PCR )等。其中，病毒中和试验(VN )和补体结合试验(CF ) 两种方法因试验复杂、麻烦、耗时、不安全、需在生物安全三级(P3)实 验室内进行，且有时产生非特异性反应，应用受到限制，且其它诊断方法 也各有其一定的局限性而无法用于快速诊断。目前，国内口岸检疫中急需VS的快速检测方法和试剂。研制快速、便捷、适合于口岸检疫和现场诊断 的检测试纸条，在水泡性口炎的快速诊断、检疫和流行病学调查中具有更重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术旨在解决水泡性口炎病毒抗原的快速^f企测问题，而提供一种无 须使用特殊的设备和专门的技术人员，即可直接、快速对水泡性口炎病毒 抗原做出4企测的水泡性口炎病毒快速^^测试纸条。本专利技术还提供了该水泡性口炎病毒快速检测试纸条的制作方法。 为实现上述目的，本专利技术提供一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条，该试纸条包括基板，它是由不透水材料制成的条形板状体；样品吸收垫，它由多孔纤维制成，该样品吸收垫内吸附有胶体金标记 的水泡性口炎病毒的单克隆抗体；硝酸纤维膜，其上设有检测线和对照线，其中，^r测线上包被或喷附 有水泡性口炎病毒多克隆抗体，对照线上包被或喷附有蛋白质A;吸水垫，且所述吸收垫、硝酸纤维膜及吸水垫沿基板的长度方向依次设置在基板 板面上。形成基板的不透水材料为聚氯乙烯。 形成样品吸收垫的多孔纤维为玻璃纤维。本专利技术还提供了所述水泡性口炎病毒快速检测试纸条的制作方法，该方 法包括如下步骤a、制备水泡性口炎病毒单克隆抗体，其制备过程为(l)水泡性口炎 病毒的纯化，用水泡性口炎病毒(VSV)接种BHK-21细胞长成单层，收获 的细胞培养病毒液反复冻融3次，以8000转/分离心30分钟，取上清液， 超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心，收获提纯的病毒条带，用核酸蛋白 分析仪测定蛋白含量为2. 4g/L, -20。C保存备用；(2)用提纯的水泡性口炎抗原加等体积弗氏完全佐剂乳化，和弗氏不完全佐剂乳化，免疫BALB/c小 鼠三次；(3)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇(MW4000 )融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA 方法检测分泌抗VSV的阳性孔；(4)用有限稀释法进行细胞克隆，经间接 ELISA篩选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗VSV的特异性单克隆抗体的 杂交瘤细胞；(5)将获得的分泌抗VSV的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞注 射入BALB/c小鼠腹腔制备单抗腹水；(6 )采集单克隆抗体腹水，测定抗体 效价、蛋白含量和亲和力，腹水ELISA效价高达为1: 1024000,用核酸蛋 白分析仪测定纯化腹水IgG的含量为1.97 g/L,亲和力分常数高达5.41x 107mol/L。用间接ELISA方法鉴定制备的单克隆抗体仅与水泡性口炎病毒 有特异性免疫反应，而与其它相关病毒(如BTV、 AKV、 EHDV、 PPRV等)没 有任何免疫反应。b、 烧制胶体金，并准备待标记单抗，然后测定胶体金标记抗体的最适 稳定量，具体地说，是由柠檬酸钠还原法烧制直径20nm~ 50nm胶体金颗粒， 取-2(TC保存的纯化好的水泡性口炎病毒的单克隆抗体，将其浓度调整为 lmg/mL, 4。C保存备用；将准备好的待标记单克隆抗体做系列稀释为 g/mL~90jag/mL,分别取lmL,加入每管lmL分装好金胶溶液中，以测定胶 体金标记抗体的最适稳定量。c、 对抗体进行交体金标记，接着对胶体金标记抗体进行纯化，具体地 说，是将2mg水泡性口炎病毒的单克隆抗体溶于100mL胶体金溶液中，在 电磁搅拌器搅拌下，緩慢将单克隆抗体溶液加入胶体金溶液中进行标记。 然后在其中加入5。/。的牛血清白蛋白使其终浓度为1%， 4。C静置2 4小时， 弃沉淀物，将胶体金溶液离心处理，弃去上清，将沉淀用含0. 01 ~ 0.06% 叠氮钠，0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液稀释为原体积的10%, 4。C保存 备用。d、 将纯化的胶体金标记抗体吸附于多孔纤维样品吸收垫上，具体地说，是将Q. 02 mol/LpH8. 6 TBS稀释金标单克隆抗体胶体金溶液浸入玻璃纤维 至液体开始渗出为止而形成金标抗体层，然后将玻璃纤维在室温温度干燥。 即制成了吸附有胶体金标记抗体的玻璃纤维。e、 在硝酸纤维膜上形成由水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质A包被或喷 附的检测线和对照线，具体地说，是在硝酸纤维膜上设定出检测线和对照 线位置，用喷膜机分别在其所在位置喷上2. 5mg/L的水泡性口炎多克隆抗 体和蛋白质A形成检测线和对照线，按2jaL/lcm设置喷膜量，喷膜后在37 。C干燥2小时，再用O.Olmol/L pH7. 2含3%牛血清白蛋白的PBS，在37 。C下封闭45分钟，用0. Olmol/L PH7. 0的PBS漂洗，再将硝酸纤维膜室温 下干燥。f、 在基板上沿长度方向将样品吸收垫、吸附有胶体金标记单克隆抗体 的玻璃纤维、包被有检测线和对照线的硝酸纤维膜和吸水垫依次设置在基 板板面上，形成检测试纸条，并将其装入塑料外壳的检测卡内。具体地说， 是将硝酸纤维膜贴于不透水基板上，再将浸润有金标记单克隆抗体混合溶 液的多孔纤维材料样品吸收垫和另 一个多孔纤维材料样品吸收垫垫分别贴 于不透水基板上，并使两者位于硝酸纤维膜的两端，在浸润有金标单克隆 抗体混合溶液的多孔纤维材料样品吸收垫上的不与硝酸纤维膜相连的一端 设置一块多孔吸水材料，以形成手柄和吸水垫。本专利技术的贡献在于，它有效解决了水泡性口炎病毒抗原的快速检测问 题。实验数据表明，本专利技术的水泡性口炎病毒抗原快速检测试纸条不仅特 异性强，敏感性高，稳定，操作简便，而且制备方法简单，使用快捷迅速， 可在10分钟之内得出结果，安全简便，不需任何仪器和设备，成本低廉， 所需试剂和样本量少，因此特别适合用于出入境口岸和基层检疫部门水泡 性口炎的现场快速诊断、检测、检疫和流行病学调查。附图说明图1为本专利技术示意图。具体实施方式下列实施例是对本专利技术的进一步解释和说明，对本专利技术不构成任何限制。1、水泡性口炎病毒的单克隆抗体制备过程(1) BHK-21细胞长成单层后接种水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括：　　　　基板（１），它是由不透水材料制成的条形板状体；　　　　样品吸收垫（２），它由多孔纤维制成，该样品吸收垫内吸附有胶体金标记的水泡性口炎病毒的单克隆抗体；　　　　硝酸纤维膜（３），其上设有检测线（４）和对照线（５），其中，检测线（４）上包被或喷附有水泡性口炎病毒多克隆抗体，对照线（５）上包被或喷附有蛋白质Ａ；　　　　吸水垫（６），且　　　　所述吸收垫（２）、硝酸纤维膜（４）及吸水垫（６）沿基板（１）的长度方向依次设置在基板（１）板面上。

【技术特征摘要】
1、一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括基板(1)，它是由不透水材料制成的条形板状体；样品吸收垫(2)，它由多孔纤维制成，该样品吸收垫内吸附有胶体金标记的水泡性口炎病毒的单克隆抗体；硝酸纤维膜(3)，其上设有检测线(4)和对照线(5)，其中，检测线(4)上包被或喷附有水泡性口炎病毒多克隆抗体，对照线(5)上包被或喷附有蛋白质A；吸水垫(6)，且所述吸收垫(2)、硝酸纤维膜(4)及吸水垫(6)沿基板(1)的长度方向依次设置在基板(1)板面上。2、 如权利要求1所述的水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于， 形成基板(1)的不透水材料为聚氯乙烯。3、 如权利要求1所述的水泡性口炎病毒快速检测试纸条，其特征在于， 形成样品吸收垫(2)的多孔纤维为玻璃纤维。4、 如权利要求1所述的水泡性口炎病毒快速检测试纸条的制作方法， 其特征在于，该方法包括如下步骤a、 制备水泡性口炎病毒单克隆抗体；b、 烧制胶体金，并准备待标记单抗，然后测定胶体金标记抗体的最适 稳定量；c、 对抗体进行胶体金标记，接着对胶体金标记抗体进行纯化；d、 将纯化的胶体金标记抗体吸附于多孔纤维样品吸收垫上；e、 在硝酸纤维膜上形成由水泡性口炎多克隆抗体和蛋白质A包被或喷 附的检测线和对照线；f、 在基板上沿长度方向将样品吸收垫、吸附有胶体金标记单克隆抗体的玻璃纤维、包被有检测线和对照线的硝酸纤维膜和吸水垫依次设置在基 板板面上，形成检测试纸条，并将其装入塑料外壳的检测卡内。5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，水泡性口 炎病毒单克隆抗体的制备是将纯化的水泡性口炎病毒免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：花群义，阮周曦，杨俊兴，杨云庆，曾少灵，张彩虹，孙洁，吕建强，秦智锋，陶虹，
申请(专利权)人：花群义，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]