本发明专利技术提供了一种适用于五氯硝基苯残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括包被了五氯硝基苯包被抗原的酶标板、浓缩洗涤液、五氯硝基苯标准品、五氯硝基苯多克隆抗体、酶标二抗、显色液、反应终止液。检测已知浓度的五氯硝基苯并绘制标准曲线，可以推算出待测五氯硝基苯的浓度。本发明专利技术的优点是能准确灵敏地检测环境中的五氯硝基苯残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。
A ELISA kit for pentachloronitrobenzene residue analysis
The invention provides a suitable for pentachloronitrobenzene residue analysis of ELISA kit, including coated pentachloronitrobenzene coated antigen ELISA plate, concentrated washing liquid, PCNB quintozene standard, polyclonal antibody, ELISA, two anti color liquid, reaction termination liquid. Fungiclor detection of known concentration and drawing the standard curve, it can calculate the concentration of analyte pentachloronitrobenzene. The advantages of the invention can accurately and sensitively detect the environment of PCNB residue, has the advantages of simple sample pretreatment, less time-consuming, can simultaneously detect a large number of samples, sample testing cost is far lower than the traditional methods of detecting instrument.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，具体地说， 涉及一种适用于五氯硝基苯残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒。
技术介绍
五氯硝基苯(PCNB)主要用作拌种剂和土壤消毒剂，用于防治棉 花苗期病害、麦类黑穗病以及蔬菜和果木的多种病害。在中草药的栽 培过程中使用量很大，尤其是作为防治人参病害的药剂在国内外广泛 使用。五氯硝基苯主要损害心血管系统、中枢神经系统、肝、肾和造 血系统。我国强制性国家标准规定在蔬菜和原粮中五氯硝基苯的最高 残留限量分别是0.2和0.1mg/kg，欧盟于2001年1月开始禁用五氯 硝基苯。五氯硝基苯的常规检测方法包括气相色谱、高效液相色谱等，应 用这些理化分析技术对环境、生物、食品等样品中痕量五氯硝基苯残 留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、 提取、净化、衍生等前处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程 需要使用大量的有机溶剂，又造成了新的环境污染。随着待检样品、 特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手 段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留快速分 析技术。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题针对上述不足，本专利技术提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准 确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测试剂盒，用于环 境中五氯硝基苯残留的批量、快速检测。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术提供了一种五氯硝基苯残留分析酶联免 疫吸附检测试剂盒，该试剂盒包括包被了五氯硝基苯包被抗原的酶标 板、浓缩洗涤液、五氯硝基苯标准品、五氯硝基苯特异性抗体、酶标 记物、底物显色液、反应终止液。其中，五氯硝基苯抗体的制备过程中所用的免疫原是五氯硝基苯 半抗原与载体蛋白的偶联复合物，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵 清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白，优选为牛血清白蛋白；所述多克 隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为兔源多克 隆抗体。其中，包被了五氯硝基苯包被抗原的酶标板的制备过程中，所用 的包被抗原是五氯硝基苯半抗原与卵清蛋白的偶联复合物，所用包被 液可以是0.05 MpH 9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1%明胶的 上述包被液。其中，酶标记物为酶标二抗，标记酶可以是辣根过氧化物酶或碱 性磷酸酶。其中，浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7~9g、 磷酸二氢钾0.1~0.3g、磷酸氢二钠2~4g、氯化钾3~6g、吐温-20 0.5~3mL。浓缩洗涤液的浓度是正常使用时的50倍。当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由A液和B液组成， 显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲 基联苯胺，终止液为1-2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液。具体地说，A 液配方可为每lOOOmL水中加入过氧化脲lg，10.3g柠檬酸，35.8gNa2 HP04'12 H20,吐温-20 100pL, pH5; B液配方可为每1000mL蒸馏 水中加入四甲基联苯胺(TMB) 700mg (仰mLDMSO溶解)，l(Ug才宁檬 酸，pH2.4-2.6。当标记酶为细菌提取碱性辚酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。 本专利技术试剂盒的分析原理是当酶标板预包被抗原时，加入待测五氯硝基苯样品和五氯硝基苯 多克隆抗体后，固相包被抗原和待测五氯硝基苯相互竟争与抗体反 应，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测 的五氯硝基苯浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶 标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物显色液，显 色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测 五氯硝基苯浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知的 五氯硝基苯浓度检测所作的标准曲线，可以推算出待测五氯硝基苯的 浓度。(三)有益效果本专利技术的优点是能准确灵敏地检测环境中的五氯硝基苯残留，样 品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成 本远低于传统的仪器检测方法。本专利技术对解决大批量样品的五氯硝基 苯残留现场监控技术具有重要的现实意义。具体实施例方式以下实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不用来限制本专利技术所 要保护的范围。实施例l试剂盒操作及结果计算待测样品经前处理后，用PBST定容备用。拆开真空包装袋并取 出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。配制0ng/mL, 10 ng/mL， 50 ng/mL, 100 ng/mL， 500ng/mL, 2000ng/mL的五氯硝基苯标准液， 加入50pL标样或处理好的样品到各孔中，标样和样品做4个重复， 加入50pL稀释的抗体，37'C孵育30分钟；倒出孔中的液体，用稀释 好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:1000稀释好的酶标羊抗兔二抗IO(VL， 37'C孵育30分钟；倒出孔中的液 体，用PBST洗板5次，拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加 IOOjiL,在37。C显色30分钟，每孔加入5(V1的终止液终止反应，酶 标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。将含0 ng/mL标准品孔的OD值减去含最大浓度标准品孔的OD 值定为B。，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B;以B/B。值为 纵坐标，相应标准品浓度的log值为横坐标，绘制五氯硝基苯标准抑 制曲线。根据曲线的回归方程可以求出对应样品的浓度，也可以求出 五氯硝基苯抑制中浓度IC50 ( B/B0=50% )及最小检测限IC20 (B/B0=80%)。其中，抑制中浓度IC5『37ng/ml，最低检测限1<:20= 7.2 ng/ml。实施例2半抗原的合成称取2g五氯酴(pentachlorophenol, PCP )和lgK2C03溶于30rnL 丙酮中，加入到反应器中，在氮气的保护下，加入1.14g溴丙酸，加 温回流反应2个小时，再加入0.5g溴丙酸，保持以上条件不变反应 过夜(反应生成的气体通入NaOH吸收瓶吸收)。减压蒸除有机溶剂， 剩余物质用浓盐酸和二氯甲烷分开，弃掉无机相，有机相用无水 Na2S04干燥，减压蒸除有机溶剂后，用硅胶柱层析净化即得到所需 半抗原粗产品。收率50%。实施例3五氯硝基苯多克隆抗体制备以活性酯法将半抗原与牛血清白蛋白偶联，称2mg偶联物溶于 lmL生理盐水中，和lmL完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射新西 兰大耳白兔大腿，以后每隔两周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂 与免疫原混合，免疫部位为颈背部皮下，从第三次免疫开始，每次免 疫后一周从兔耳静脉釆血检测血清效价。总共免疫5次，最后一次免 疫后一周从兔颈动脉釆全血，用35%的饱和硫酸铵盐析法粗提兔抗血 清，最后用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获得较纯的五氯硝基苯多克隆抗体。DE-52阴离子交换纯化抗体(1) DE-52预处理以lmg粗IgG需5g湿重纤维素计算，称 适量DE-52加0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸馏水反复洗至中性；接 着用0.5mol/LHCl浸泡30min ,蒸馏水反复洗至中性；再用 0.5mol/LNaOH浸泡30min,蒸馏水反复洗至中性，最后用O.01mo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于五氯硝基苯残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括包被五氯硝基苯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、五氯硝基苯标准品、五氯硝基苯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。
【技术特征摘要】
1.一种适用于五氯硝基苯残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒，包括包被五氯硝基苯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、五氯硝基苯标准品、五氯硝基苯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。2. 根据权利要求l所述的酶联免疫吸附检测试剂盒，其中，五氯 硝基苯抗体在制备过程中所用的免疫原是五氯硝基苯半抗原与载体 蛋白BSA的偶联复合物；所述五氯硝基苯抗原是五氯硝基苯与载体 蛋白OVA的偶联复合物。3. 根据权利要求1或2所述的酶联免疫检测试剂盒，其中，所述 酶标记物是酶标二抗。4. 根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其中，所述酶标 二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。5. 根据权利要求1或2所述的酶联免疫吸附检测试剂盒，其中， 浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7~9g、磷酸二氢 钾0.1 0.3g、磷酸氢二钠2 4g、氯化钾3 6...
【专利技术属性】
技术研发人员：李季，许艇，邵晓龙，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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