本发明专利技术提供了一种适用于功夫菊酯残留检测的酶联免疫吸附分析试剂盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。本发明专利技术的优点是能准确灵敏地检测水中功夫菊酯残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。
An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay kit for the determination of Cyhalothrin residues
The invention provides a suitable cyhalothrin residue detection ELISA kit, including coated cyhalothrin antigen ELISA plate, concentrated washing liquid, cyhalothrin, cypermethrin standard specific antibody, enzyme marker, chromogenic substrate solution and reaction termination liquid. The advantages of the invention can accurately and sensitively detect the residues of Cyhalothrin in water, has the advantages of simple sample pretreatment, less time-consuming, can simultaneously detect a large number of samples, sample testing cost is far lower than the traditional methods of detecting instrument.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种功夫菊酯残留的间接竟争酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，主要适用于大批量水样品中功夫菊酯残留的快 速测定。
技术介绍
功夫菊酯是一种合成菊酯类农药，广泛的应用于农作物与畜舍 的害虫杀灭与预防。在我国，功夫菊酯主要用于棉花、茶叶、果树 和蔬菜种植中。然而，功夫菊酯是一种高毒物质，对于大鼠和小鼠 的经口半数致死量(LC5o)分别为79mg/Kg和56mg/Kg，而对于鱼 类 (LC50=0.078-2.3|ig/L ) 和水生的无脊稚动物 (LC50=0.0023-3.3|ig/L)的毒性更高。而且，功夫菊酯在环境中的 残留时间也比较长，它在土壤，植物和脂肪组织中的半衰期分别为 30、 40和23天。并且有研究显示功夫菊酯可以在鱼类的体内累积， 从而有可能影响人类的健康。常用的功夫菊酯的分析方法主要有高压液相色谱法，气相色谱 连接电子捕获检测器法和液质联用法。应用这些理化分析技术对环 境、生物、食品等样品中痕量功夫菊酯残留进行分析，不仅仪器化 程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前 处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机 溶剂，又造成了新的环境污染。随着待检样品、特别是要求现场快 速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求， 因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留快速分析技术。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决目前农药残留仪器分析方法成本高和操作复杂以及快 速检测技术中特异性差、灵敏度低和检测结果不稳定等缺点，本发 明提供了一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操 作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的功夫菊酯残留的间接竟争酶联免疫吸附分析试剂盒。 (二)技术方案本专利技术试剂盒包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、 功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和 反应终止液。其中，所述包被抗原是3-[(±)氰基[(±)-(顺式)-3-[(Z型)-3-氯-4,4， 4-三氟-1-乙基-2, 2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体 蛋白的偶联复合物，所述载体蛋白优选为卵清蛋白。其中所述功夫菊酯特异性抗体是由3-[(±)氰基[(±)-(顺式)-3-[(Z 型)_3_氯_4， 4， 4-三氟-l-乙基-2， 2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧 基]苯丙酸与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得，可以是通过杂交瘤 方法制备得到的单克隆抗体，或者是直接免疫动物得到的多克隆抗 体。所述，载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清 白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用 载体蛋白，优选为牛血清白蛋白；所述多克隆抗体可以是鼠源、马 源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为兔源多克隆抗体。其中，包被抗原的酶标板的制备过程中，所用包被液可以是0.05 MpH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1%明胶的上述包被液。其中，酶标记物为酶标二抗，标记酶可以是辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶。其中，浓缩洗涤液的配方为每20mL蒸馏水中加入氯化钠7~ 9g、磷酸二氢钾0.1~0.3g、磷酸氢二钠2 4g、氯化钾3 6g、吐温 -20 0.5~3mL。浓缩洗涤液的浓度是正常使用时的50倍。当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液由A液和B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲 基联苯胺，终止液为1 2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液。具体地说，A 液配方可为每1000mL水中加入过氧化脲lg，10.3g柠檬酸，35.8g Na2 HPCV12 H20,吐温-20 100pL， pH5; B液配方可为每1000mL蒸 馏水中加入四甲基联苯胺(TMB) 700mg (40mL DMSO溶解)，10.3g 梓檬酸，pH2.4-2.8。当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显 色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。 本专利技术试剂盒的分析原理是当酶标板预包被抗原时，加入待测功夫菊酯样品和多克隆抗体， 固相包被抗原和待测功夫菊酯相互竟争与抗体反应，由于每个孔中 的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测的功夫菊酯浓度 高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定 抗体结合量少，最后加入底物液和显色液，显色反应浅，用酶标仪 检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测功夫菊酯浓度低时， 则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知的功夫菊酯浓度检测所 作的标准曲线，可以推算出待测功夫菊酯的浓度。(三)有益效果本专利技术的优点是能准确灵敏地检测不同来源的水样中功夫菊酯 残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品， 样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本专利技术对解决大批量样 品的功夫菊酯残留现场监控技术具有重要的现实意义。附图说明图l功夫菊酯的标准抑制曲线。具体实施例方式下面实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的 限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。 实施例l试剂盒操作及结果计算待测样品经前处理后，用含甲醇50。/。的PBS定容备用。拆开真 空包装袋并取出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。配制Ong/mL, 5 ng/mL ， 10 ng/mL ， 100 ng/mL, 1000 ng/mL ， 10000 ng/mL的功夫 菊酯标准液，加入50pL标样或处理好的样品到各孔中，标样和样品 做2 4个重复，加入50pL稀释的抗体，37。C孵育30分钟；倒出孔 中的液体，用稀释好的PBST洗2 6次，将酶标板倒置在吸水纸上 拍干；加入按1:1000稀释好的酶标羊抗兔二抗100pL， 37'C孵育30 分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板2-6次，拍干；取A液和B 液等体积混匀，每孔加100pL,在暗处显色10-15分钟，每孔加入 50pL的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的 OD值。将含0标准液孔的OD值减去含最大浓度标准液孔的OD值定 为Bo，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B;以B/Bo值为纵坐 标，相应标准品浓度的log值为横坐标，绘制功夫菊酯标准抑制曲 线(附图1 )。其中，曲线回归方程为Y = -0.448X+ 1.201,R2= 0.993，, 抑制中浓度IC50=37^ig/L,最低检测限IC10= 4.7吗/L。实施例2半抗原3-[( ± )氰基[(± )-(cis)-3-[(Z)-3-氯-4，4，4-三氟-l-乙 基-2，2-二甲基环丙基羰基氧沐氧基]苯丙酸的合成4-羟基苯丙酸苯甲酯的合成250 mL三口瓶中加入14.4g对羟基苯丙酸,27mL节醇，15mL 甲苯，滴入4滴85。/。的H3P04，回流，分水，反应需10 h。蒸馏除去 过量甲苯，减压蒸去苄醇，残余物溶于乙醚中，分别用饱和NaHC03 溶液、水洗涤三次。无水MgS04干燥，蒸去低沸物，减压蒸馏。收 集234-236°C (4mm Hg)馏分，得无色粘液4-羟基苯丙酸苯甲酯 16.1g,收率72.5%。1-澳-3-(二甲氧基甲基)苯的合成18.5g间溴苯甲醛，12.2g 甲酸三甲酯，1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测功夫菊酯残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。
【技术特征摘要】
1.一种检测功夫菊酯残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，包括包被功夫菊酯抗原的酶标板、浓缩洗涤液、功夫菊酯标准品、功夫菊酯特异性抗体、酶标记物、底物显色液和反应终止液。2. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于制备功夫菊酯特 异性抗体的免疫原为3-[(士)氰基[(士)-(顺式)-3-[(Z型)-3-氯-4， 4， 4-三氟-l-乙基-2，2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体蛋 白的偶联复合物。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述功夫菊 酯抗原为3-[(±)氰基[(±)-(顺式)-3-[(2型)-3-氯-4， 4， 4-三氟-1-乙基-2， 2-二甲基]-环丙基羰基氧基]苯氧基]苯丙酸与载体蛋白的偶联复合 物。4. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记 物为酶标记二抗。5. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的浓缩 洗涤液的配方为每20mL...
【专利技术属性】
技术研发人员：李季，许艇，高宏斌，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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