【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，特别涉及一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal调控多酚含量及抗病性的应用。
技术介绍
1、植物的代谢分为初级代谢与次级代谢。植物的次级代谢有多条途径，苯丙烷类代谢途径是其中很重要的一条。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,pal)基因通过产生调节植物生长反应的次生代谢物，在植物生长、发育、适应和减缓各种环境和病原体胁迫的反应中发挥着重要作用。pal基因被证实在烟草多酚类物质合成中发挥重要功能；以及通过参与植保素与木质素合成在植物抗逆境中的作用中具有重要作用。它们能直接防止病原物生长发育、侵染或直接形成病原菌入侵的机械屏障，从而对生物胁迫抗性增强。
2、苯丙氨酸解氨酶广泛存在于各种植物和少数微生物和某些藻类中,动物体内尚未发现。1961年，首次从绿色植物中发现pal，随着研究发现pal家族是一个非常大的多基因家族。该家族在烟草中有4个成员，在番茄和马铃薯中有20多个拷贝。目前对于烟草中具体pal基因与烟草花叶病相关基因功能研究较少，苯丙氨酸解氨酶基因编码的各种蛋白质被认为参与了不同的次级代谢途径，例如结构成分的形成或植物防御，但具体参与的植物生理途径有待研究确定。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal调控多酚含量及抗病性的应用，其为烟草育种及抗病抗逆提供理论基础。
2、本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
3、本申请
4、优选地，所述ntpal基因编码蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示，包括671个氨基酸。
5、优选地，所述ntpal基因发生编辑的植株的创制方法具体包括：
6、(1)选择ntpal基因中较特异的23nt核苷酸序列为crispr/cas9的引导序列，并将该序列片段与crispr/cas9载体进行连接、转化和pcr扩增检测，获得pcr阳性克隆，得到crispr/cas9-ntpal编辑载体；
7、(2)利用所构建的crispr/cas9-ntvha-a1编辑载体质粒，进行遗传转化，以敲除植物体内的ntpal基因，获得ntpal基因编辑植株。
8、优选地，步骤(1)中ntpal基因中较特异的23nt核苷酸序列如seq idno.5所示。
9、本申请的第二目的在于提供一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal在防治烟草花叶病毒中的应用。
10、本申请的第三目的在于提供一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal在筛选烟草花叶病抗病品种中的应用，ntpal基因编辑植株与对照植株花叶病抗性比较，ntpal基因编辑植株较对照植株更易感烟草花叶病。
11、本申请的第四目的在于提供一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal在提高成熟期烟草多酚含量中的应用，ntpal基因编辑植株中新绿原酸、莨菪亭、隐绿原酸、绿原酸及芸香苷含量显著高于对照。
12、本申请的第五目的在于提供一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal在提高成熟期烟草多分含量中的应用，ntpal基因编辑植株中苯丙氨酸解氨酶活性显著低于对照。
13、本专利技术上述技术方案，具有如下有益效果：
14、本专利技术通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除ntpal基因的crispr/cas9编辑载体，经遗传转化后获得了ntpal基因发生编辑的红花大金元突变体植株。
15、本专利技术通过在正常条件下，生长过程中进行ntpal基因编辑植株与对照(未转化)植株花叶病抗性比较，ntpal基因编辑植株较对照(未转化)植株更易感烟草花叶病。成熟期多酚含量包括新绿原酸、莨菪亭、隐绿原酸、绿原酸及芸香苷等主要多酚含量测定高于对照(未转化)。成熟期苯丙氨酸解氨酶活性在编辑植株中显著低于对照植株中的活性。
16、综上所述，利用crispr/cas9介导的基因编辑技术敲除ntpal基因获得影响植株花叶病抗性基因编辑植株，该基因对于烟草多酚含量调控及烟草花叶病抗性具有重要作用，这为烟草苯丙氨酸解氨酶研究及烟草抗病性研究提供理论基础。
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1.一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL，其特征在于，所述基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，包括2016bp个碱基。
2.根据权利要求1所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL，其特征在于，NtPAL基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括671个氨基酸。
3.根据权利要求1-2任一所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL，其特征在于，所述NtPAL基因发生编辑的植株的创制方法包括：
4.根据权利要求3所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL，其特征在于，步骤(1)中NtPAL基因中较特异的23nt核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.一种根据权利要求1-4任一所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL在防治烟草花叶病中的应用。
6.一种根据权利要求1-4任一所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL在筛选烟草花叶病抗病品种中的应用，其特征在于，NtPAL基因编辑植株与对照植株花叶病抗性比较，NtPAL基因编辑植株较对照植株更易感烟草花叶病。
7.一种根据权利要求1-4任一所述的烟草苯丙氨酸
8.一种根据权利要求1-4任一所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因NtPAL在提高成熟期烟草多分含量中的应用，其特征在于，NtPAL基因编辑植株中苯丙氨酸解氨酶活性显著低于对照。
...【技术特征摘要】
1.一种烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal，其特征在于，所述基因核苷酸序列如seq idno.1所示，包括2016bp个碱基。
2.根据权利要求1所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal，其特征在于，ntpal基因编码蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示，包括671个氨基酸。
3.根据权利要求1-2任一所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal，其特征在于，所述ntpal基因发生编辑的植株的创制方法包括：
4.根据权利要求3所述的烟草苯丙氨酸解氨酶基因ntpal，其特征在于，步骤(1)中ntpal基因中较特异的23nt核苷酸序列如seq id no.5所示。
5.一种根据权利要求1-4任一所述的烟草苯丙氨酸解氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：许力，许永，高茜，黄海涛，蒋佳芮，米其利，杨文武，李晶，李雪梅，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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