【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物模型构建，具体涉及肢芽间充质干细胞中fkbp10基因条件性敲除小鼠模型的建立及其应用。
技术介绍
1、bruck综合征(bs)是一种罕见的常染色体隐性成骨不全症，主要表现为先天性关节挛缩、骨脆性、婴儿或幼儿开始的多发性骨折、四肢畸形和脊柱侧弯等。fkbp脯氨酰异构酶10(fk506 binding protein10,fkbp10)基因为一种高度保守的蛋白质编码基因，也称为oi6、oi11、brks1、fkbp65、ppiase、hfk-bp65，属于fkbp型肽基脯氨酰顺反式异构酶家族，起分子伴侣的作用。
2、fkbp10基因突变可致bruck综合征(bs)，然而其致病机制仍不清楚。fkbp10表达于骨骼、肌腱和韧带中。近期，有报道使用成骨细胞特异性col1a1 2.3kb cre重组酶小鼠成骨细胞中敲除fkbp10基因，发现在该动物模型中，骨的数量的变化很小，且骨基质矿化的程度没有差异，未表现出成骨不全表型。表明fkbp10突变导致的成骨不全症状不是由于fkbp10在成骨细胞中的作用缺失而导致。
3、因此需要构建出一种可以表现出明显成骨不全症状的fkbp10基因敲除模型，以为布鲁克综合征的机制研究和药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种肢芽间充质干细胞中fkbp10基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本专利技术人利用crispr/cas9技术，构建了在肢芽间充质干细胞中敲除fkb
2、本专利技术所采取的技术方案是：
3、本专利技术的第一方面，提供一种fkbp10基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
4、s1：通过crispr/cas9技术对小鼠fkbp10基因进行flox修饰，获得flox小鼠；
5、s2：将flox小鼠与组织特异性cre工具鼠杂交，得到fkbp10基因条件敲除小鼠模型。
6、优选地，步骤s1中所述对小鼠fkbp10基因进行flox修饰的具体步骤为在小鼠fkbp10基因的第2-6外显子序列两端插入loxp序列。
7、优选地，步骤s1中通过crispr/cas9技术并通过同源重组在小鼠fkbp10基因的第2-6号外显子序列两端插入loxp序列。
8、优选地，所述同源重组中，cas9蛋白在grna引导下结合到靶位点，进而造成fkbp10基因dna双链断裂，靶位点位于fkbp10基因2-6号外显子的两侧，靶位点grna1和grna2的dna序列为：
9、grna1：tgctggggagtaaatgctcctgg；
10、grna2：aatgcactgcacatcactcatgg。
11、优选地，所述同源重组中采用的供体载体(donor vector)包括3.0kb 5’同源臂、2.4kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂。
12、优选的，所述步骤s1的具体步骤为：
13、1.1)依据对fkbp10基因所进行的flox修饰，设计靶向fkbp10基因的grna并构建用于同源重组的供体载体；
14、1.2)将cas9 mrna、grna、供体载体同时注射到野生型小鼠的受精卵中，然后将受精卵移植到母鼠体内孕育传代得到杂合小鼠；
15、1.3)将完成flox修饰的杂合小鼠，获得纯合小鼠。
16、优选地，所述cre工具鼠的cre酶特异性表达于肢芽间充质干细胞。
17、优选地，所述步骤s2具体包括以下步骤：
18、2.1)将所述纯合fkbp10flox/flox小鼠与cre工具鼠交配并获得cre阳性杂合fkbp10flox/+-prx1 cre小鼠；
19、2.2)将所述cre阳性杂合转基因fkbp10flox/+-prx1 cre小鼠与纯合子转基因fkbp10flox/flox小鼠交配，获得cre阳性的纯合转基因小鼠fkbp10flox/flox-prx1 cre，即条件性敲除基因fkbp10小鼠模型。
20、优选地，所述构建方法中还包括对小鼠的基因型进行鉴定的步骤。
21、优选地，鉴定所述小鼠基因型的方法包括pcr方法，所用的引物的序列包括seq idno:1～seq id no:4。
22、本专利技术的第二方面，提供本专利技术第一方面所述构建方法构建的动物模型在以下任一项中的应用：
23、(1)制备布鲁克综合征动物模型；
24、(2)筛选治疗布鲁克综合征的药物；
25、(3)布鲁克综合征的机制研究；
26、(4)fkbp10基因在骨骼发育、骨形成中的功能研究。
27、本专利技术的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术第一方面所述的cas9蛋白、grna和供体载体。
28、优选地，所述试剂盒还包括seq id no:1～seq id no:4所示的dna引物。
29、本专利技术的有益效果是：
30、本专利技术中提供了一种在肢芽间充质干细胞中条件性敲除fkbp10基因的小鼠模型的构建方法；本专利技术首次发现在肢芽间充质干细胞中条件性敲除fkbp10之后有明显的骨量减少与关节挛缩畸形，解决了既往对于fkbp10布鲁克综合征的研究在成骨细胞中条件敲除fkbp10基因之后没有成骨不全表型的问题；对于后续研究fkbp10基因在骨骼发育及骨形成中的功能提供了很好的动物模型和应用价值；可以直接用于研究fkbp10导致布鲁克综合征的机制以及成骨不全等骨形成障碍性障碍的发病机制，具有重要的应用价值。
31、本专利技术说明可以将蛋白质编码基因fkbp10及其上下游生物传导通路作为药物治疗布鲁克综合征疾病的新靶点。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种肢芽间充质干细胞中FKBP10基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述对小鼠FKBP10基因进行flox修饰的具体方法为在小鼠FKBP10基因的第2-6外显子序列两端插入LoxP序列。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA包括gRNA1和gRNA2；
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述供体载体包括5’同源臂、2.4kb的flox区域和3’同源臂。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Cre工具鼠的Cre酶特异性表达于肢芽间充质干细胞。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法中还包括对小鼠的基因型进行鉴定的步骤；
9.权利要求1～8任一项所述构建方法构建的动物模型在以下任一项中的应用：>
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求5所述的gRNA、供体载体和/或Cas9蛋白；
...【技术特征摘要】
1.一种肢芽间充质干细胞中fkbp10基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中所述对小鼠fkbp10基因进行flox修饰的具体方法为在小鼠fkbp10基因的第2-6外显子序列两端插入loxp序列。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤s1的具体步骤为：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述grna包括grna1和grna2；
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述供体载体包括5’同源...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱明伟，尚丽媛，唐亚平，徐宏文，李霞，农恬颖，李朝晖，徐益波，李敬春，
申请(专利权)人：广州医科大学附属妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。