【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在基因治疗和/或脱氧核糖核酸(dna)疫苗中具有高表达效率的表达构建体的开发，更详细地，涉及基于pvax1载体通过插入最佳的人巨细胞病毒(hcmv)毒株的全长hcmv ie调控区和转录区来制备的外源基因表达用重组表达构建体。
技术介绍
1、所有基因治疗剂根据递送治疗基因的递送体(载体)的种类分为病毒型和非病毒型，其中，最多使用的是安全性高的质粒脱氧核糖核酸和表达效率优秀的腺病毒及腺相关病毒。其中，质粒脱氧核糖核酸主流基因治疗剂的基础表达效率低，因此，用来提高治疗基因的表达效率的研究正活跃地进行着。
2、用于提高治疗基因的表达效率的方法最常见为三个方向的研究，第一为通过启动子的组合等来改善表达载体的研究，第二为改善对疾病最优的基因的研究，最后是用来提高生物体内递送效率的研究。本专利技术为其中通过基因表达启动子的比较及筛选来开发在真核细胞中示出最佳的表达效率的载体的研究。
3、hcmv启动子为最强启动子之一，有多种hcmv毒株(strain)，其中具有代表性的毒株为towne和ad169等。hcmv即早期(immediate-early，ie)基因的主要(major)启动子的碱基序列都很相似，几乎没有随毒株的序列差异，但包含ie基因的内含子a(intron a)的全长hcmv ie调控区和转录区序列在每种hcmv毒株中都示出碱基序列的差异。据过去查普曼(chapman)等人的报告，在启动子中包含hcmv towne毒株的内含子a(全长hcmv调控区和转录区)的情况下，在gp120和gp160基因
4、现在处于许可阶段、临床三期实验以及多数在临床试验中使用的pvax1载体使用ad169毒株的hcmv ie基因的主要启动子，但在试验中已知虽具有突出的安全性，但表达效率不高，因此，有许多研究人员在致力于基于该载体来提高表达效率的研究。
5、上述
技术介绍
中说明的事项仅用于增进对本专利技术背景的理解，不应作为本专利技术所属
的普通技术人员已知的现有技术来认可和接受。
6、现有技术文献
7、专利文献
8、韩国授权专利第10-0562824号
技术实现思路
1、技术问题
2、本专利技术人致力于开发适合在基因治疗和/或脱氧核糖核酸疫苗中使用且在真核细胞内的表达效率高的载体。结果，确认到在利用hcmv 3157毒株的全长hcmv ie调控区和转录区的情况下，与利用来源于其他毒株的全长hcmv ie调控区和转录区相比，基因的表达效率显著增加，从而完成本专利技术。
3、因此，本专利技术的目的在于，提供重组表达构建体(recombinant expressionconstruct)。
4、本专利技术的再一目的在于，提供包含与hcmv 3157毒株的全长hcmv ie调控区和转录区序列具有90％以上同源性的序列的重组表达构建体。
5、本专利技术的另一目的在于，提供外源基因(transgene)表达用重组表达构建体。
6、本专利技术的还一目的在于，由上述重组表达构建体或外源基因表达用重组表达构建体转导(transduction)的宿主细胞。
7、本专利技术的又一目的在于，提供制备上述重组表达构建体或外源基因表达用重组表达构建体的方法。
8、本专利技术的又一目的在于，提供上述外源基因表达用重组表达构建体的治疗用途(for use in therapy)。
9、本专利技术的又一目的在于，提供外源基因的表达方法，包括向有需要的对象(subject)给药治疗有效量的上述外源基因表达用重组表达构建体的步骤。
10、本专利技术的又一目的在于，提供包含药学上有效量的上述外源基因表达用重组表达构建体及药学上可接受的载体的药物组合物。
11、本专利技术的其他目的及优点将通过下述专利技术的详细说明、专利技术要求保护范围以及附图得以进一步明确。
12、技术方案
13、根据本专利技术的一实施方式，本专利技术提供重组表达构建体。
14、本说明书中的术语“载体”或“构建体”是指能够插入核酸或基因的构建体，优选地，包括用来向能够复制核酸序列的细胞导入的能够插入核苷酸序列的递送体。核酸序列外源的(exogenous)或异源的(heterologous)。核酸序列可以为外源基因。构建体可以为质粒、粘粒及病毒(例如，腺相关病毒(aav))，但不限定于此。本专利技术所属
的普通技术人员可以通过标准的重组技术构建上述载体或构建体(maniatis,et al.,molecularcloning,a laboratory manual,cold spring harbor press,cold spring harbor,n.y.,1988；及ausubel et al.,in:current protocols in molecular biology,john,wiley&sons,inc,ny,1994等)。
15、本说明书中的术语“不表达载体”或“表达构建体”是指包含编码被转录的基因产物中的至少一部分的核苷酸序列的载体或构建体。在部分情况下，之后核糖核酸(rna)分子被翻译为蛋白质、多肽或肽。表达构建体可以包含多种调控序列(regulatory regions)。除调节转录及翻译的调控序列以外，载体及表达载体中还可以包含提供其他功能的核苷酸序列。上述调节要素中可以包括增强子、启动子、外显子、内含子、剪接供体及受体序列等。并且，上述调节要素中可以包含用于终止转录的序列(例如，poly a等)、用于稳定表达外源基因的序列(例如，wpre序列等)、用于减少外源基因-特异性免疫的发生的序列(例如，微小核糖核酸(mirna)靶向序列等)。
16、本说明书中的术语“可操作地连接”或“能操作的连接”是指连接的脱氧核糖核酸序列以能够执行所希望的功能的方式相邻来设置，例如，在特定启动子有助于开始编码序列(例如，外源基因)的转录的情况下，这样的启动子可以与编码区域可操作地连接。启动子与编码区域不需要为保持这样的功能关系而相邻设置。
17、本说明书中的术语“全长hcmv ie调控区和转录区”或“full hcmv ieregulatoryand transcribed regions”是指包含增强子(enhancer)、启动子(promoter)、内含子a等来作为调控区和转录区的结构。“主要hcmv ie启动子”或“major hcmv ie promoter”是指上述“全长hcmv ie调控区和转录区”中缺失内含子a等非必需部位的结构。
18、根据本专利技术的优选实例，上述hcmv 3157毒株的全长hcmv ie调控区和转录区序列包含序列24的序列。
19、根据本专利技术的优选实例，上述重组表达构建体包含外源基因插入用多克隆位点(mcs)。
20、例如，外源基因为人肝细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组表达构建体，其特征在于，包含序列24的序列。
2.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述序列24的序列为HCMV3157毒株的全长HCMVIE调控区和转录区。
3.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体包含外源基因插入用多克隆位点。
4.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体还包含多腺苷酸化序列。
5.根据权利要求4所述的重组表达构建体，其特征在于，上述多腺苷酸化序列选自由人生长激素多腺苷酸化序列、牛生长激素多腺苷酸化序列、猿猴空泡病毒40早期多腺苷酸化序列及猿猴空泡病毒40晚期多腺苷酸化序列组成的组中。
6.根据权利要求5所述的重组表达构建体，其特征在于，上述多腺苷酸化序列包含选自由序列30至序列33组成的组中的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体还包含抗生素抗性基因。
8.根据权利要求7所述的重组表达构建体，其特征在于，上述抗生素抗性基因选自由氨苄青霉素、卡那霉素、
9.根据权利要求8所述的重组表达构建体，其特征在于，上述抗生素抗性基因包含序列28或序列29的序列。
10.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体具有图4的图谱。
11.一种外源基因表达用重组表达构建体，
12.根据权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述序列24的序列为HCMV 3157毒株的全长HCMV IE调控区和转录区序列。
13.根据权利要求12所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，与插入选自由序列20的HCMV Towne毒株的全长HCMVIE调控区和转录区序列、序列22的HCMV AD169毒株的全长HCMVIE调控区和转录区序列以及序列26的HCMV CINCY及Towne毒株的全长HCMVIE调控区和转录区序列组成的组中的调控区和转录区的情况相比，上述外源基因表达用重组表达构建体的外源基因的表达增加。
14.根据权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述外源基因包括肝细胞生长因子或其变异体基因、新冠病毒刺突基因、新冠病毒刺突受体结合结构域基因、转化生长因子-β基因、胰岛素样生长因子1基因或β干扰素基因。
15.根据权利要求14所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述肝细胞生长因子或其变异体基因包含选自由序列1、序列16至序列19组成的组中的基因。
16.根据权利要求14所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述新冠病毒刺突基因包含序列4的基因。
17.根据权利要求14所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述新冠病毒刺突受体结合结构域基因包含序列9的基因。
18.根据权利要求14所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述转化生长因子-β基因包含序列34的基因。
19.根据权利要求14所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述胰岛素样生长因子1基因包含序列37的基因。
20.根据权利要求14所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述β干扰素基因包含序列40的基因。
21.一种宿主细胞，其特征在于，由权利要求1所述的重组表达构建体或权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体转导而来。
22.一种重组表达构建体的制备方法，其特征在于，包括向pVAX1载体插入序列24的序列的步骤。
23.根据权利要求22所述的重组表达构建体的制备方法，其特征在于，上述制备方法还包括向上述重组表达构建体插入外源基因的步骤。
24.一种外源基因表达用重组表达构建体的制备方法，其特征在于，包括向权利要求1所述的重组表达构建体插入外源基因的步骤。
25.一种权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体的治疗用途。
26.一种外源基因的表达方法，其特征在于，包括向有需要的对象给药治疗有效量的权利要求1所述的外源基因表达用重组表达构建体的步骤。
27.一种药物组合物，其特征在于，包含药学上有效量的权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体及药学上可接受的载体。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其特征在于，上述药物组合物为用于预防或治疗心血管疾病...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种重组表达构建体，其特征在于，包含序列24的序列。
2.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述序列24的序列为hcmv3157毒株的全长hcmvie调控区和转录区。
3.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体包含外源基因插入用多克隆位点。
4.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体还包含多腺苷酸化序列。
5.根据权利要求4所述的重组表达构建体，其特征在于，上述多腺苷酸化序列选自由人生长激素多腺苷酸化序列、牛生长激素多腺苷酸化序列、猿猴空泡病毒40早期多腺苷酸化序列及猿猴空泡病毒40晚期多腺苷酸化序列组成的组中。
6.根据权利要求5所述的重组表达构建体，其特征在于，上述多腺苷酸化序列包含选自由序列30至序列33组成的组中的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体还包含抗生素抗性基因。
8.根据权利要求7所述的重组表达构建体，其特征在于，上述抗生素抗性基因选自由氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、氯霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、红霉素、万古霉素、青霉素、壮观霉素、氯霉素、磺胺嘧啶及甲氧苄啶抗性基因组成的组中。
9.根据权利要求8所述的重组表达构建体，其特征在于，上述抗生素抗性基因包含序列28或序列29的序列。
10.根据权利要求1所述的重组表达构建体，其特征在于，上述重组表达构建体具有图4的图谱。
11.一种外源基因表达用重组表达构建体，
12.根据权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述序列24的序列为hcmv 3157毒株的全长hcmv ie调控区和转录区序列。
13.根据权利要求12所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，与插入选自由序列20的hcmv towne毒株的全长hcmvie调控区和转录区序列、序列22的hcmv ad169毒株的全长hcmvie调控区和转录区序列以及序列26的hcmv cincy及towne毒株的全长hcmvie调控区和转录区序列组成的组中的调控区和转录区的情况相比，上述外源基因表达用重组表达构建体的外源基因的表达增加。
14.根据权利要求11所述的外源基因表达用重组表达构建体，其特征在于，上述外源基因包括肝细胞生长因子或其变异体基因、新冠病毒刺突基...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡成炫，朴秀振，
申请(专利权)人：吉恩博生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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