【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及光控dna聚合酶、核酸片段、重组载体、重组细胞与应用。
技术介绍
1、dna人工合成技术是现代基因技术的重要基础。dna人工合成的关键方法包括：柱式化学寡核苷酸合成、芯片化学寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、寡核苷酸拼装、基因合成纠错与克隆筛选、大片段基因合成组装，以及dna的新一代酶法合成。dna人工合成的传统方法大多依赖亚磷酰胺完成化学反应。近年来以酶促合成为原理的第三代dna人工合成逐渐崛起，成为前景广阔的dna人工合成方法。其中以末端脱氧核苷酸转移酶（tdt）为核心的酶促合成技术是极具前景的dna合成策略。
2、新型核苷酸酶促合成法是利用非模板依赖性的tdt进行体外的寡核苷酸片段合成。tdt由bollum首先发现并提出该酶可用于单链寡核苷酸的合成。随后schott和schrade研究发现，tdt对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链dna可产生长达8000nt的均聚物。为了实现tdt催化的可控dna合成，tdt的活性需要被可逆控制。keasling团队在2018年构建的tdt催化活性控制机制利用了tdt与单个核苷酸的可逆共价键连接，用于阻止tdt催化合成的dna链的进一步延伸，当该可逆共价键断裂后，dna链便可进入新的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7%，单个循环仅需2~3min。基于创新tdt的dna合成得到了学术界和工业界的普遍关注。由于tdt越发显著的dna合成应用，针对tdt开展酶工程设计以实现tdt酶活性的灵活调控具有重要意义。
3、
4、因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
1、基于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供光控dna聚合酶、核酸片段、重组载体、重组细胞与应用，旨在解决现有利用cplov2实现tdt活性受光学调控的光控dna聚合酶在黑暗与蓝光照射条件下的催化活性差异不够显著的问题。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面，提供一种光控dna聚合酶，其中，所述光控dna聚合酶包括tdt和cplov2，所述tdt的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述cplov2嵌入在所述tdt的第202号苯丙氨酸残基和第203号丝氨酸残基之间。
4、可选地，所述cplov2由核心结构域pas和jα螺旋构成。
5、可选地，在蓝光照射条件下所述jα螺旋变成松散的柔性结构，在黑暗条件下所述松散的柔性结构变成jα螺旋。
6、可选地，所述cplov2的氨基酸序列如seq id no：2所示。
7、 可选地，所述光控dna聚合酶的氨基序列如seq id no：3所示。
8、本专利技术的第二方面，提供一种核酸片段，其中，所述核酸片段包含编码本专利技术如上所述的光控dna聚合酶的核苷酸序列。
9、本专利技术的第三方面，提供一种重组载体，其中，所述重组载体含有本专利技术如上所述的核酸片段。
10、本专利技术的第四方面，提供一种重组细胞，其中，所述重组细胞含有本专利技术如上所述的重组载体。
11、本专利技术的第五方面，提供一种本专利技术如上所述的光控dna聚合酶、由本专利技术如上所述的核酸片段表达得到的dna聚合酶、由本专利技术如上所述的重组载体表达得到的dna聚合酶或由本专利技术如上所述的重组细胞表达得到的dna聚合酶在催化dna合成反应中的应用。
12、可选地，所述光控dna聚合酶催化脱氧核苷酸重复添加到单链dna的3’羟基端或双链dna的3’羟基端。
13、有益效果：本专利技术提供的光控dna聚合酶能在不同光照条件下呈现出显著差异化的酶活性，在蓝光照射和黑暗条件下活性差异达到上百倍（在蓝光条件下的活性是在黑暗条件下的106.14倍），实现催化活性的可逆光学调控，且具有催化效率高、稳定性高、可控性强的特点，具有广阔的应用前景。本专利技术利用光控dna聚合酶活性的光学控制技术，改善了传统dna聚合酶合成dna时可控性差、合成反应步骤多、依赖去保护过程的局限。相比于生物合成法，本专利技术利用光控dna聚合酶活性的光学控制技术，初步代替了传统的人工紫外或化学试剂去保护步骤，减少了反应步骤，提高了合成效率，同时降低了合成成本，为dna聚合酶的可控合成提供了变革性新策略。
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1.一种光控DNA聚合酶，其特征在于，所述光控DNA聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶和cpLOV2，所述末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述cpLOV2嵌入在所述末端脱氧核苷酸转移酶的第202号苯丙氨酸残基和第203号丝氨酸残基之间。
2.根据权利要求1所述的光控DNA聚合酶，其特征在于，所述cpLOV2由核心结构域PAS和Jα螺旋构成。
3.根据权利要求2所述的光控DNA聚合酶，其特征在于，在蓝光照射条件下所述Jα螺旋变成松散的柔性结构，在黑暗条件下所述松散的柔性结构变成Jα螺旋。
4.根据权利要求1所述的光控DNA聚合酶，其特征在于，所述cpLOV2的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
5.根据权利要求1所述的光控DNA聚合酶，其特征在于，所述光控DNA聚合酶的氨基序列如SEQ ID NO：3所示。
6.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段包含编码权利要求1-5任一项所述的光控DNA聚合酶的核苷酸序列。
7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求6所述的核酸片
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求7所述的重组载体。
9.一种权利要求1-5任一项所述的光控DNA聚合酶、由权利要求6所述的核酸片段表达得到的DNA聚合酶、由权利要求7所述的重组载体表达得到的DNA聚合酶或由权利要求8所述的重组细胞表达得到的DNA聚合酶在催化DNA合成反应中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述光控DNA聚合酶催化脱氧核苷酸重复添加到单链DNA的3’羟基端或双链DNA的3’羟基端。
...【技术特征摘要】
1.一种光控dna聚合酶，其特征在于，所述光控dna聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶和cplov2，所述末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述cplov2嵌入在所述末端脱氧核苷酸转移酶的第202号苯丙氨酸残基和第203号丝氨酸残基之间。
2.根据权利要求1所述的光控dna聚合酶，其特征在于，所述cplov2由核心结构域pas和jα螺旋构成。
3.根据权利要求2所述的光控dna聚合酶，其特征在于，在蓝光照射条件下所述jα螺旋变成松散的柔性结构，在黑暗条件下所述松散的柔性结构变成jα螺旋。
4.根据权利要求1所述的光控dna聚合酶，其特征在于，所述cplov2的氨基酸序列如seqid no：2所示。
5.根据权利要求1所述的光控dna聚合酶，其特征在于，所述光控...
【专利技术属性】
技术研发人员：於邱黎阳，阮华明，陈柳青，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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