【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及消化液，尤其涉及一种消化液及其应用。
技术介绍
1、胃癌是全球第五大常见癌症和中国第二大致命恶性肿瘤，严重危害人类健康。早期胃癌患者无明显症状，多数胃癌患者确诊时已发展至中晚期。胃癌细胞对化疗药物敏感性较差，因此其化疗效果差，导致五年生存率低。类器官培养是在三维环境中培养出的特定组织器官包含的多种细胞类群，组成与体内器官相似，其培养体系与体内微环境更为接近。近年来随着类器官技术的快速发展，类器官模型在基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗等领域广泛运用。然而类器官的操作时间长，培养成功率低很大程度减少了在精准医学领域的运用。
2、hans clevers团体在2018年首次建立了46个胃癌类器官样本库，源于胃癌患者切除组织来源的胃癌类器官保留了肿瘤组织病理学和肿瘤基因突变特征。
3、申请号为【cn202111201771.3】的专利中公开了一种胃癌类器官及其培养方法、培养用培养基和用途，该专利通过将胃癌组织细胞与培养基和基质胶混合，得到待培养物，进而培养成胃癌类器官。申请号为【cn202211029016.6】的专利中公开了一种原发性胃癌类器官的培养基及其培养方法，该专利通过调整培养中各种组分的含量，能够实现对异质性巨大的原发性胃癌细胞进行类器官培养。但都存在制备操作复杂、原代肿瘤组织消化时间长，容易降低细胞活性，进而导致类器官的培养成功率低。根本原因是胃癌的瘤间和瘤内异质性相比其它肿瘤更大，细胞的活性低，导致单一的胃癌类器官培养基培养成功率低下，因此胃癌细胞的活性对胃癌类器官的成功培
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种消化液及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
3、本专利技术的第一方面是提供一种消化液，包括如下成分：advanced dmem/f-12培养基，glutamax supplement 1-2％，hepes1-3％，烟酰胺1-20mm，n-乙酰半胱氨酸1-10mm，y-276321-50μm，青霉素-链霉素2-4％，胶原酶i0.1-0.5mg/ml，胶原酶ii 0.2-0.8mg/ml，胶原酶v 0.3-0.8mg/ml，中性蛋白酶0.2-0.8mg/ml，透明质酸酶0.1-0.8mg/ml。
4、进一步地，所述消化液包括如下成分：advanced dmem/f-12培养基，glutamaxsupplement 1％，hepes1％，烟酰胺1mm，n-乙酰半胱氨酸1.25mm，y-2763250μm，青霉素-链霉素3％，胶原酶i 0.5mg/ml，胶原酶ii 0.8mg/ml，胶原酶v 0.8mg/ml，中性蛋白酶0.8mg/ml，透明质酸酶0.8mg/ml。
5、本专利技术的第二方面是提供上述消化液在胃癌组织类器官培养中的应用，胃癌组织类器官培养包括如下步骤：
6、步骤一，获取胃癌类器官组织样本，将胃癌类器官组织样本用预冷的pbs缓冲液反复清洗，剪碎并切成体积为1-1.5mm3的碎片，加入3-5ml所述消化液至50ml离心管，得到组织混合液；
7、步骤二，加3倍体积组织混合液的预冷pbs缓冲液至离心管，终止原代消化，通过移液管反复吹打组织混合液直至组织碎片消失，取出200-500ul消化后的溶液，当在显微镜下观察为均匀的细胞团时，通过低温低速离心，重悬细胞团，显微镜对细胞团数量进行计数，根据需要接种的孔数，将相应的细胞团转移至离心管，300-500g离心5-10min；
8、步骤三，将步骤二所得到的细胞团加入预冷的基底胶中重悬，并接种至tc细胞培养板内，当基底胶凝固后，在tc细胞培养板内加入改良advanced dmem/f-12培养基培养，每1-3天观察并更换培养基；
9、步骤四，胃癌类组织类器官培养5-7天后，向所述tc细胞培养板中加入0.8-1ml预冷的pbs缓冲液，将基底胶转移至离心管，反复吹打，转移至冰箱内静置10-20min，300-500g离心5-10min，去除上清，获得胃癌组织类器官；
10、步骤五，将所述步骤四获得的胃癌组织类器官进行酶解消化，并获得胃癌组织类器官碎片；
11、步骤六，将步骤五获得的胃癌组织类器官碎片使用基底胶重悬，调整细胞浓度为200-300个/30μl，接种入24孔板，待基底胶凝固后加入胃癌组织类器官的培养基；
12、步骤七，培养5-7天后，重复步骤四-六，持续培养3-5代后，冻存胃癌组织类器官。
13、进一步地，步骤三中，所述tc细胞培养板为6孔、12孔、24孔或48孔。
14、进一步地，所述改良advanced dmem/f-12培养添加有：r-spondin1500ng/ml，n21％，b271％，glutamax supplement 1％，hepes1％，烟酰胺10mm，青霉素-链霉素1％，n-乙酰半胱氨酸1.25mm，a-83015μm，胃泌素i15nm，egf 30ng/ml，noggin 30ng/ml，y-2763215μm，chir990215μm，wnt-3a30ng/ml，前列腺素e21μm/ml，成纤维细胞生长因子30ng/ml，insulin 1μm/ml，transferrins 100ug/ml。
15、进一步地，步骤四中，冰箱设置的温度为4℃。
16、进一步地，步骤五中，使用tryple express对获得的类器官碎片进行酶解消化。
17、更进一步地，步骤五中，所述酶解消化具体操作步骤为：加1-2ml的trypleexpress，消化2-3min，边吹打边消化，加入6-8ml预冷的pbs缓冲液，300g离心5min，终止酶解消化。
18、本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
19、采用本专利技术的消化液，并结合本专利技术的胃癌组织类器官培养方法，胃癌类器官的培养成功率达到87.5％；采用本专利技术的消化液，控制原代消化时间在20min以内，减少了类器官的原代时间，极大地缩短了培养时间，提高了细胞的活性和培养成功率。
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1.一种消化液，其特征在于，所述消化液包括如下成分：
2.根据权利要求1所述的消化液，其特征在于，所述消化液包括如下成分：AdvancedDMEM/F-12培养基，GlutaMAX Supplement 1％，HEPES1％，烟酰胺1mM，N-乙酰半胱氨酸1.25mM，Y-2763250μM，青霉素-链霉素3％，胶原酶I0.5mg/mL，胶原酶II 0.8mg/mL，胶原酶V 0.8mg/mL，中性蛋白酶0.8mg/mL，透明质酸酶0.8mg/mL。
3.如权利要求1-2任一项所述的消化液在胃癌组织类器官培养中的应用，其特征在于，所述胃癌组织类器官培养包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤三中，所述TC细胞培养板为6孔、12孔、24孔或48孔。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改良Advanced DMEM/F-12培养添加有：R-spondin1500ng/ml，N21％，B271％，GlutaMAX Supplement 1％，HEPES1％，烟酰胺10mM，青霉素-链霉素1％，N-乙酰半胱
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤四中，冰箱设置的温度为4℃。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤五中，使用TrypLE Express对获得的类器官碎片进行酶解消化。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤五中，所述酶解消化具体操作步骤为：加1-2ml的TrypLE Express，消化2-3min，边吹打边消化，加入6-8ml预冷的PBS缓冲液，300g离心5min，终止酶解消化。
...【技术特征摘要】
1.一种消化液，其特征在于，所述消化液包括如下成分：
2.根据权利要求1所述的消化液，其特征在于，所述消化液包括如下成分：advanceddmem/f-12培养基，glutamax supplement 1％，hepes1％，烟酰胺1mm，n-乙酰半胱氨酸1.25mm，y-2763250μm，青霉素-链霉素3％，胶原酶i0.5mg/ml，胶原酶ii 0.8mg/ml，胶原酶v 0.8mg/ml，中性蛋白酶0.8mg/ml，透明质酸酶0.8mg/ml。
3.如权利要求1-2任一项所述的消化液在胃癌组织类器官培养中的应用，其特征在于，所述胃癌组织类器官培养包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤三中，所述tc细胞培养板为6孔、12孔、24孔或48孔。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改良advanced dmem/f-12培养添加有：r-spondin1500ng/ml，n21％，b271％，gl...
【专利技术属性】
技术研发人员：卫子然，张鑫，王伟军，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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