【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、脂质纳米颗粒(lnp)已作为生物相容的和稳定的药物递送平台而广泛开发。用于制备脂质纳米颗粒的脂质通常是低毒性的生理脂质(生物相容的和可生物降解的)。脂质的理化多样性和生物相容性及其增强药物的口服生物利用度的能力使得脂质纳米颗粒成为非常有吸引力的药物递送载体。此外，基于脂质的配制物可通过多种方式积极地影响药物吸收，包括：增加溶解能力、防止药物在肠道稀释时沉淀、增强膜通透性、抑制外排转运蛋白、减少cyp酶、增强乳糜微粒产生和淋巴转运。lnp为用于sirna递送的主要非病毒载体，并且截至2019年，在70％的纳米医学临床试验中被采用。anselmo s等人，2019,bioeng.transl.med.4(3):e10143。
2、基于脂质的纳米载体给药品的质量控制带来了另外的挑战，部分是由于其复杂的理化性质。根据美国fda最近发布的关于脂质体药品的指南，这些配制物应指定质量属性，包括颗粒结构和尺寸分布、颗粒表面的理化性质、脂质含量、游离api的量和包封效率、以及物理和化学稳定性。不同的制备条件和参数可能影响lnp配制物的质量属性。例如，脂质组合物，特别是并入不同量和/或分子量的经聚乙二醇化的脂质，显著影响脂质体的胶体稳定性、细胞摄取和药代动力学(参见，例如，allen等人，1991,biochem biophys acta,1066(1):29-36；garbuzenko等人，2005,chem phys lipids,135(2):117-29；immordino等人，int j nanomedicin
3、lnp结构和运载物递送受四种主要组分调节：可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质(peg-脂质)。阳离子可电离脂质在lnp配制期间促进带负电荷的核酸的包封，并且有助于在内体ph范围5.5至6.5下运载物的胞质内递送。辅助脂质和胆固醇可增加结构稳定性，促进膜融合，并增强lnp的内体逃逸。添加peg-脂质的影响是多方面的，并且导致了所谓的“peg-困境”。peg-脂质对于在自组装期间控制粒度并防止颗粒聚集是必要的。然而，亲水性peg冠会阻碍颗粒表面与亲脂性细胞膜之间的相互作用，导致细胞内化不良。peg的存在还可以阻止lnp经由受体介导的内吞作用进行细胞内化所必需的转运蛋白的表面结合。此外，peg-脂质还通过充当血浆蛋白(包括调理素)吸附的空间屏障来延长体内lnp循环时间。虽然延长半衰期增加治疗性暴露量，但增加lnp循环可能诱导抗peg抗体生成，导致不良过敏反应。
4、因此，实现有效的细胞内递送高度依赖于了解多元peg-脂质的作用以克服peg困境。先前的研究表明，调整peg尺寸、架构、含量、碳尾类型、以及长度可调节lnp功效。
技术实现思路
1、为了满足基于脂质的纳米药物的筛选和优化的需要，本公开提供用于制备包封各种治疗性有效载荷的此类基于脂质的纳米颗粒的高通量筛选(hts)工作流程。在各种实施例中，本专利技术提供一种经优化的溶剂注入方法，用于使用机器人液体处理器进行lnp的简便自组装。在各种实施例中，描述了有效载荷的最优脂质组成、总脂质浓度和负载量。
2、在各种实施例中，本公开涉及一种用于制造脂质纳米颗粒(lnp)制剂的经优化的高通量筛选方法，该方法包括：a.获得包含水相的第一溶液；b.获得包含有机相和多个能够自组装的分子的第二溶液，并且其中所述第一溶液和所述第二溶液是可混合的；c.将至少一种有效载荷分子溶解于第一溶液或第二溶液中；d.使用机器人液体处理器来制备具有不同组成的所述相并将所述相分配到多个孔中；e.在适合于lnp形成的条件下使用所述机器人液体处理器混合所述第一溶液和所述第二溶液以获得包封所述有效载荷的脂质纳米颗粒；其中下列条件中的至少一者在不同的孔之间是变化的：自组装分子的类型、所述自组装分子的组成比率；所述自组装分子与所述有效载荷的比率和/或浓度、相的选择、缓冲液类型和ph、注入顺序、注入速度、混合速度、体积、相比率、注入持续时间以及混合持续时间；f.测量下列中的至少一者：所述lnp的包封效率、粒度分布、纯化和颗粒回收率、以及配制物稳定性；g.确定用于制造所述lnp制剂的最优参数；以及h.基于所述最优参数制造所述lnp制剂。
3、如本文所指出的，脂质纳米颗粒(lnp)越来越多地用于改善核酸的递送效率和治疗性功效。已发现各种配制物参数可影响这些纳米颗粒配制物的质量属性。然而，目前缺乏有效的系统筛查方法来应对这些挑战。根据本专利技术，已经开发了自动化高通量筛选(hts)工作流程，用于简化负载有例如反义寡核苷酸(aso)的lnp的制备和分析性表征。根据本专利技术，可以在短短3小时内在完整的96孔板中进行该表征。
4、根据本专利技术，使用机器人液体处理器通过自动溶剂注入方法配制负载aso的lnp，并且评定具有不同配制物组成和aso负载的粒度分布、包封效率和稳定性。本文所述的结果表明经聚乙二醇化的脂质含量显著影响粒度分布，而可电离脂质/aso电荷比率影响aso的包封效率。此外，我们的hts方法的结果与使用微流体配制器的最先进的放大方法的结果相关，从而为稳健的配制物开发和实验方法的设计提供一种新颖方法。该方法可以将材料使用量减少至约十分之一，从而将分析输出和信息积累改善约100倍。
5、已开发了一种新颖hts工作流程来制备aso-lnp并分析其peg-脂质含量与粒度分布之间的关系。使用高通量液体处理器，以不同的peg-脂质摩尔比(1至5mol％)制备并配制含有跨磷酸甘油酯、甘油二酯和神经酰胺家族的多种peg-脂质的不同aso-lnp的文库。本文描述peg-脂质参数的影响，包括分子量(mw)、碳尾长度、以及摩尔比。另外，本文描述许多另外的peg-脂质变量，包括peg架构、脂质尾部饱和度、peg-脂质电荷和接头化学。
6、在各种实施例中，有效载荷为寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为反义寡核苷酸。在各种实施例中，寡核苷酸为sirna。在各种实施例中，寡核苷酸为shrna。在各种实施例中，寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在各种实施例中，有效载荷为mrna。在各种实施例中，mrna的尺寸为约500至3000个核苷酸。在各种实施例中，有效载荷为多肽。在各种实施例中，所述多肽在约1,000da与约10,000da之间。在各种实施例中，有效载荷为小分子。在各种实施例中，小分子在约100da与1000da之间。
7、在各种实施例中，有效载荷溶解于第一溶液中。在各种实施例中，有效载荷溶解于第二溶液中。在各种实施例中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于制造脂质纳米颗粒(LNP)制剂的经优化的高通量筛选方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为siRNA。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述寡核苷酸为shRNA。
6.根据权利要求2至5所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为mRNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中mRNA的尺寸为约500至约3000个核苷酸的长度。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽在约1,000Da至约10,000Da之间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述小分子在约100Da至1000Da之间。
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于制造脂质纳米颗粒(lnp)制剂的经优化的高通量筛选方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸为sirna。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述寡核苷酸为shrna。
6.根据权利要求2至5所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为mrna。
8.根据权利要求7所述的方法，其中mrna的尺寸为约500至约3000个核苷酸的长度。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽在约1,000da至约10,000da之间。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述小分子在约100da至1000da之间。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一溶液包含ph受控和渗透压受控的缓冲液。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自由以下项组成的组：阳离子脂质物质、可电离脂质物质、非阳离子脂质物质、磷脂物质和非磷脂物质。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
22.根据权利要求1所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mm之间变化。
24.根据权利要求1所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
26.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的n:p比率是变化的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述n:p比率在约0.5至约5之间变化。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述lnp为聚合物脂质纳米颗粒。
29.根据权利要求1至27所述的方法，其中所述lnp为脂质体。
30.根据权利要求1至27所述的方法，其中所述lnp为脂蛋白纳米颗粒。
31.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
32.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的lnp的那些参数。
35.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述lnp在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
36.一种用于优化用于制造脂质纳米颗粒(lnp)制剂的工艺的高通量方法，所述方法包括：
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述寡核苷酸为sirna。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述寡核苷酸为shrna。
41.根据权利要求37至42所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为mrna。
43.根据权利要求42所述的方法，其中mrna的尺寸为约1kb至约2kb。
44.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
45.根据权利要求45所述的方法，其中所述多肽在约1,000da至约10,000da之间。
46.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述小分子在约100da至1000da之间。
48.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
49.根据权利要求36所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
50.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
51.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一溶液包含ph受控和渗透压受控的缓冲液。
52.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
53.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
54.根据权利要求36所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
57.根据权利要求36所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
58.根据权利要求57所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mm之间变化。
59.根据权利要求54或55所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
60.根据权利要求59所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
61.根据权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的n:p比率是变化的。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述n:p比率在约0.5至约5之间变化。
63.根据权利要求36至62中任一项所述的方法，其中所述lnp为聚合物脂质纳米颗粒。
64.根据权利要求36至62所述的方法，其中所述lnp为脂质体。
65.根据权利要求36至62所述的方法，其中所述lnp为脂蛋白纳米颗粒。
66.根据权利要求36所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
67.根据权利要求36所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
68.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
69.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的lnp的那些参数。
70.根据权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述lnp在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
71.一种用于将有效载荷包封在液体纳米颗粒(lnp)制剂中的经优化的高通量方法，所述方法包括：
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述寡核苷酸为sirna。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述寡核苷酸为shrna。
76.根据权利要求72至75所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
77.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为mrna。
78.根据权利要求77所述的方法，其中mrna的尺寸为约1kb至约2kb。
79.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述多肽在约1,000da至约10,000da之间。
81.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述小分子在约100da至1000da之间。
83.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
84.根据权利要求71所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
85.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
86.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一溶液包含ph受控和渗透压受控的缓冲液。
87.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
88.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
89.根据权利要求71所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一种脂质分子物质的脂质组分。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述至少一种脂质分子物质选自阳离子脂质物质、非阳离子脂质物质和磷脂物质。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述第二溶液包含多于一种类型的脂质。
92.根据权利要求89或90所述的方法，其中脂质的总浓度是变化的。
93.根据权利要求92所述的方法，其中脂质的所述总浓度在约0.4至约4mm之间变化。
94.根据权利要求89或90所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的百分比是变化的。
95.根据权利要求94所述的方法，其中经聚乙二醇化的脂质的所述百分比在总脂质组成的约0.5％至约5％之间变化。
96.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述有效载荷的n:p比率是变化的。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述n:p比率在约0.5至约5之间变化。
98.根据权利要求71至97中任一项所述的方法，其中所述lnp为聚合物脂质纳米颗粒。
99.根据权利要求71至97所述的方法，其中所述lnp为脂质体。
100.根据权利要求71至97所述的方法，其中所述lnp为脂蛋白纳米颗粒。
101.根据权利要求71所述的方法，其中将所述第一溶液注入所述第二溶液中。
102.根据权利要求71所述的方法，其中将所述第二溶液注入所述第一溶液中。
103.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生大于80％的所述有效载荷的包封效率的那些参数。
104.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述最优参数为产生平均直径为80至200nm、具有单峰尺寸分布和小于约30％的多分散性的lnp的那些参数。
105.根据权利要求71至102中任一项所述的方法，其中所述lnp在4摄氏度溶液中的储存下将类似的尺寸分布和有效载荷包封维持至少一个月。
106.一种向有需要的患者施用lnp制剂的方法，其中所述lnp制剂通过以下来制造：
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为寡核苷酸。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述寡核苷酸为反义分子。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述寡核苷酸为sirna。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述寡核苷酸为shrna。
111.根据权利要求107至110所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。
112.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为mrna。
113.根据权利要求112所述的方法，其中mrna的尺寸为约1kb至约2kb。
114.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为多肽。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述多肽在约1,000da至约10,000da之间。
116.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷为小分子。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述小分子在约100da至1000da之间。
118.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第一溶液中。
119.根据权利要求106所述的方法，其中所述有效载荷溶解于所述第二溶液中。
120.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一溶液为水性缓冲液。
121.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一溶液包含ph受控和渗透压受控的缓冲液。
122.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括甲醇。
123.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二溶液的所述有机相包括乙醇。
124.根据权利要求106所述的方法，其中所述自组装分子至少包括包含至少一...
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