一种合成普兰林肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种固相合成普兰林肽的方法，包括以下步骤：１）由Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ和取代度为０．３－１．５ｍｍｏｌ／ｇ的氨基树脂，得到Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－氨基树脂；２）将Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸；３）利用碘进行固相氧化使巯基成环；４）裂解普兰林肽－树脂得到普兰林肽粗肽；５）纯化得到普兰林肽。本发明专利技术工艺采用Ｆｍｏｃ固相合成策略，利用多种偶联剂体系和二肽片段偶联法，采用固相氧化，具有反应操作简单、成本低、且收率较高等特点，适合规模化生产。

A method for synthesis of peptide

The invention discloses a method for solid phase synthesis of pramlintide, which comprises the following steps: 1) by Fmoc Tyr (tBu) - amino resin OH and the degree of substitution is 0.3 1.5mmol / g, Fmoc - Tyr (tBu) - amino resin; 2) Fmoc Tyr (tBu) - protection according to the sequence of amino acid peptide resin step coupling remaining; 3) were made into a ring by using solid phase oxidation of thiol iodine; 4) cracking pramlintide resin to obtain crude pramlintide; 5) purified pramlintide. Fmoc solid phase synthesis method and the process of the invention, using a variety of coupling agent system and two peptide coupling method using solid phase oxidation reaction, with simple operation, low cost, and the yield is high, suitable for large-scale production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种合成多肽的合成方法，尤其涉及降血糖多肽药物的固相合成方法。
技术介绍
最先，人们从胰岛的13细胞分泌物中发现了一种能减缓食物在小肠吸收速度的多肽，即由37个氨基酸残基构成的多肽激素(amylin)。该多肽激素通过抑制高血糖素来减少肝糖的产生，减少患者食欲，协助机体调节血糖水准，但该多肽激素在溶液中并不稳定，易水解，粘稠性大，易凝结的特性，不适合做成药物用于治疗。经人工筛选，进行结构改造，合成了一种稳定的类似物，上述多肽激素与合成的类似物之间的差异在于前者第25， 28和29位上氨基酸被脯氨酸所取代，这种合成的类似物就是普兰林肽。 普兰林肽用于辅助治疗I型及II型糖尿病，主要用于单用胰岛素，以及联合应用胰岛素和磺脲类药物无效的患者。 普兰林肽的化学分子式为<formula>formula see original document page 3</formula>
技术实现思路
本专利技术提出了一条较适当的路线，操作方便、时间较短，收率较高、适合规模化生产。为实现上述目的，本专利技术提供，包括以下步骤 1)用固相合成方法由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为O. 3-1. 5mmol/g的氨基树脂，得到Fmoc-Tyr (tBu)-氨基树脂； 2)将Fmoc-Tyr (tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸； 3)使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除，利用碘进行固相氧化； 4)裂解普兰林肽_树脂得到普兰林肽粗肽； 5)经过纯化得到普兰林肽。 所述的步骤1)中Fmoc-Tyr (tBu)-氨基树脂取代值范围在0. 3-1. 5mmol/g，优选为0. 3-0. 5mmol/g。固相合成方法特指多肽的固相合成法。氨基树脂一般为Rink AmideMBHA树脂，Sieber树脂，Rink AmideAM树脂，Rink Amide树脂或Rink Amide BHA树脂，优选Rink Amide树脂。 所述的步骤2)中保护氨基酸是指C端采用Fmoc保护的氨基酸，有些氨基酸如，Lys， Cys， Asn， Thr， Gln， Arg， His, Ser， Tyr也需要其它保护基保护，详细参见下文的本专利技术合成方法示意。其中，氨基酸偶联体系为固相偶联体系DIC或DIEA中的一个或两个，与H0BT、H0AT、Cl-H0BT、HBTU、HATU、PyB0P或PyA0P中的任意一个或一个以上，组成偶联体系。例如DIC+H0AT， DIEA+HBTU， DIEA+HOAT+HBTU或DIEA+HOBT+PyBOP等。 偶联体系优选的组合为HOBT、 HOAT、 C1-H0BT中的任意一个或一个以上与DIC组合；例如HOBT+DIC， C1-H0BT+DIC或者H0BT+C1-H0BT+DIC ; 或偶联体系优选的组合为DIEA与HOBT、 HOAT或C1-H0BT中的任意一个或一个 以上与HBTU、 HATU、 PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成多组分偶联体系。例 如DIEA+HOBT+HBTU， DIEA+HOAT+HATU， DIEA+HOBT+HOAT+PyAOP， DIEA+HOBT+HATU+PyBOP， DIEA+Cl-HOBT+PyBOP或DIEA+HOBT+HOAT+HBTU+PyAOP。其中所述的多组分偶联剂可以是 3组分偶联剂、4组分偶联剂、5组分偶联剂、6组分偶联剂、7组分偶联剂或8组分偶联剂。 实验发现，采用本专利技术的多种偶联剂体系，能够显著提高反应效率。 进一步说步骤2)合成C端第四位氨基酸、C端第五位氨基酸的偶联采用 Fmoc-Gly-Ser(WMe，Me pro)-0H。选用Fmoc-Gly-Ser (WMe，M印ro)-OH效果好于单独选用 Fmoc-Ser (tBu) -OH和Fmoc-Gly-0H。 Fmoc-Gly-Ser (WMe，Me pro) -0H为受Fmoc保护2肽 片段。其中Fmoc-Gly-Ser(WMe， Me pro)即Fmoc-Gly-Ser (psiMe Me pro)-OH，默克公司 上海办事处品牌商标名为Novabiochem，产品货号05-20-1127-lGM。 实验发现，受Fmoc保护二肽片段溶解性好，易于偶联，与单独选用 Fmoc-Ser (tBu)-OH和Fmoc-Gly-OH相比，反应会更加完全，且得到的副产物少；有利于纯 化，并能大大提高收率； 所述的步骤3)利用碘进行固相氧化，目的是使巯基成环。碘用量范围是普兰林肽 摩尔比的5-20倍，优选15倍；氧化时间范围是4-16小时，优选6小时。固相氧化法反应时 间较短，方便操作，容易控制，对设备要求低，成本低，适合规模化生产； 所述的步骤4)裂解试剂是切割试剂是三氟乙酸(TFA)，捕获试剂是水、三异丙基 硅烷、三乙基硅烷、苯甲硫醚、苯甲醚和乙二硫醇等试剂的一种或几种的组合。优选TFA/苯 甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚体积比为90/5/3/2，室温下反应2-3小时，其中乙二硫醇是指1， 2-乙二硫醇。裂解液用量是肽树脂重量的10-12倍，沉降乙醚用量是裂解液体积的10-12 倍。 步骤5)经过反相高效液相纯化得到普兰林肽。 本专利技术工艺采用Fmoc固相策略合成长肽，中间采用二肽片段而非通常的逐个偶 联法，同时利用固相氧化，具有反应操作简单、成本低、且收率较高等特点，反应的总收率可 达20%，适合规模化生产，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广 泛的应用前景。 本专利技术合成方法示意如下 Fmoc-Tyr(R!)-OH +氨基树脂 步骤l:去Fmoc-^ H-Tyr -氨基树脂重复步骤l 重复步骤2Fmoc-Tyr (R^)-氨基树脂歩骤2:偶联 Fmoc-Thr(Rt)-OHHBTU/HOB細EAFmoc-Thr(Rt)-Tyr (R!)-氨基树脂H-Lys(R4)-Cys(R2)-Asn(R2)-Thr(R,)-Ala隱Thr(R,)-Cys(R2)-Ala-Thr(R,)-Gln(R2)-Arg(R3)-Leu-Ala-Asr^R^-Phe-Leu-Val-HisCR^-SertRO-SeitRD-Asi^R^-Asi^R^-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(R))-Asn(R2)-Val-Gly-Ser(R4)-Asn(R2)-Thr(R,)-Tyr(R,)-氨基树脂I2 H陽Lys(R4)-(j:ys-Asn(R2)-Thr(Ri)-Ala-Thr(R, )-C「-Ala-Thr(R' )-Gln(R2)-Arg(R3)-Le -Ala-Asn(R2)-Phe-Leu-Val-HisCR^-SeKRD-SeKRO-Asi^R^-AsiXR^-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(R,)-Asn(R2)-Val-Gly-Ser(R!)-Asn(R2)-Thr(Ri)-Tyr(R,)-氨基树脂Ser-^Lsn-isn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2粗肽普兰林肽精肽 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成普兰林肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：　　１）用固相合成方法由Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ和取代度为０．３－１．５ｍｍｏｌ／ｇ的氨基树脂，得到Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－氨基树脂；　　２）将Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸　　３）使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除，利用碘进行固相氧化；　　４）裂解普兰林肽－树脂得到普兰林肽粗肽；　　５）经过纯化得到普兰林肽；　　其中，所述的步骤１）中氨基树脂为Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＭＢＨＡ树脂，Ｓｉｅｂｅｒ树脂，Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＡＭ树脂，Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ树脂或Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ＢＨＡ树脂。

【技术特征摘要】
一种合成普兰林肽的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用固相合成方法由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和取代度为0.3-1.5mmol/g的氨基树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂；2)将Fmoc-Tyr(tBu)-氨基树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸3)使两个半胱氨酸巯基侧链保护基脱除，利用碘进行固相氧化；4)裂解普兰林肽-树脂得到普兰林肽粗肽；5)经过纯化得到普兰林肽；其中，所述的步骤1)中氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂，Sieber树脂，Rink Amide AM树脂，Rink Amide树脂或Rink Amide BHA树脂。2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的步骤l)中氨基树脂的取代度为0. 3_0. 5mmol/g。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中采用氨基酸偶联体系进行逐步偶联，偶联体系为DIC或DIEA中的一个或两个，与H0BT、 H0AT、 C1-H0BT、 HBTU、 HATU、PyB0P或PyA0P中的任意一个或一个以上，组成偶联体系。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的偶联体系为H0BT、H0AT、C1-H0BT中的任意一个或一个以上与DIC ;...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳陵，李红玲，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳市翰宇药业有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]