【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物检测，具体涉及一种用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒。
技术介绍
1、惠普尔养障体(tropheryma whippelii)是一种革兰氏阳性菌，大小约0.25-2.5μm，属于放线菌门养障体属，基因组富含核苷酸鸟嘌呤和胞嘧啶，广泛存在于周围环境和健康带菌者。惠普尔养障体是一种基因缺陷型细菌，其三羧酸循环途径基因完全缺失，生长增殖所需要的氨基酸等营养成份全部依靠宿主提供，是一种共生菌。研究发现，惠普尔病(whipple’s disease，wd)是由惠普尔养障体引起的可累及多系统病变的慢性感染性疾病。其临床表现多样，可以表现出慢性感染、急性感染、以及无症状携带者。通常情况下，疾病早期出现发热、关节炎或关节痛的感染症状，疾病晚期会出现特征性的腹泻、体重下降、肝脾肿大、腹水等，还会累及其他脏器，尤其是心脏、中枢神经系统及眼部，表现出多样的无特征性的临床症状。在惠普尔病患者中，大部分病人表现为间断和游走性单关节或多关节痛，一半以上患者被误诊为炎症性关节炎。消化道是另外一个主要受累的器官，近75％患者出现腹泻，80-90％患者体重下降。超过1/3的患者出现腹痛或发热的症状。此外，约25％的患者会出现抽搐、记忆减退、焦虑抑郁，甚至痴呆精神等神经系统症状。还有少数患者表现出心内膜炎、心包炎、心肌炎，深部淋巴结肿大及头痛、乏力、肌痛等非特异症状。由于惠普尔病临床表现复杂多样、人们对其缺乏了解、以及临床诊断方法的局限性，该病常被误诊或长时间得不到确诊，最终造成严重后果甚至死亡。
2、目前针对惠普尔养障体的
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒。
2、一种用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增引物、荧光探针、pcr检测试剂、阳性对照、阴性对照和无酶水。
3、所述特异性扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；所述荧光探针的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。
4、所述正向引物和反向引物的工作浓度均为0.1-1.0μm，荧光探针的工作浓度均为0.1-1.0μm，优选的，所述正向引物和反向引物的工作浓度为0.25-0.5μm，荧光探针的工作浓度为0.25-0.5μm。
5、所述荧光探针为taqman探针或taqman-mgb探针，荧光探针的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团，其中修饰5’端的荧光基团选自fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5；修饰3’端的淬灭基团选自tamra、mgb、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl。
6、所述pcr检测试剂包含tris-hcl缓冲液、taq dna聚合酶、mgcl2、dntps mixture，所述taq dna聚合酶为热启动hot start pcr酶，有效抑制非特异性扩增，提高pcr扩增效率和检测灵敏度，可达10copies/μl。
7、所述阳性对照为含有惠普尔养障体靶标基因序列的重组质粒，载体骨架为puc57，核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；所述阴性对照为te缓冲液。
8、一种快速检测惠普尔养障体的方法，按照如下步骤进行：
9、(1)将待检测样本核酸、阳性对照分别取1μl加入荧光定量pcr反应管中，并向各管中加入引物探针混合液1.5μl、pcr反应液10μl，添加无酶水补足到20μl；混合均匀后，盖好管盖，放入荧光定量pcr仪中进行检测；
10、(2)荧光pcr的扩增：95-98℃预变性5-30秒，95-98℃变性5-30秒，50-60℃退火并延伸30-60秒，循环30-50次；
11、(3)检测结果分析，若阴性对照ct值≤38时无检测信号，而阳性对照ct值≤38时有检测信号，检测结果有效；若否则检测结果无效，需重新加样实验；若待测样本ct值≤38，则判定检测结果为阳性，若ct值＞38，则判定检测结果为阴性。
12、所述待检测样本类型为痰液、肺泡灌洗液、脑脊液或口咽拭子。
13、所述荧光pcr试剂盒在检测惠普尔养障体中的应用。
14、本专利技术的有益效果：本专利技术试剂盒解决了惠普尔养障体无法通过培养方法进行鉴定的技术难题。与传统培养方法相比较，采用荧光pcr技术，检测灵敏度更高，特异性更强，极大地缩短了病原菌的鉴定时间。与高通量测序方法相比，荧光pcr检测方法操作简单、实验周期短(1-2小时)、检测费用低，更适合快速排查临床样本中的惠普尔养障体，同样也适用于宏基因组测序结果的复核。本专利技术针对惠普尔养障体16srrna基因保守区域，设计特异性扩增引物和探针序列，通过反复验证、方法优化，比较不同引物之间的特异性、灵敏性和重复性的优劣，最终优选出的引物和探针具有扩增效率高、特异性好、抗干扰能力强等优势，实现对复杂样本中微量核苷酸的定性或定量检测。本专利技术试剂盒不仅为本领域技术人员提供可以借鉴的检测方法，而且可以填补国内惠普尔养障体检测试剂盒的产品缺口，具有很好的临床应用价值和市场前景。
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1.一种用于快速检测惠普尔养障体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增引物、荧光探针、PCR检测试剂、阳性对照、阴性对照和无酶水。
2.根据权利要求1所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述正向引物和反向引物的工作浓度均为0.1-1.0μM，荧光探针的工作浓度均为0.1-1.0μM，优选的，所述正向引物和反向引物的工作浓度为0.25-0.5μM，荧光探针的工作浓度为0.25-0.5μM。
4.根据权利要求1所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光探针为TaqMan探针或TaqMan-MGB探针，荧光探针的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团，其中修饰5’端的荧光基团选自FAM
5.根据权利要求1所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂包含Tris-HCl缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs Mixture，所述Taq DNA聚合酶为热启动Hot Start PCR酶。
6.根据权利要求1所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有惠普尔养障体靶标基因序列的重组质粒，载体骨架为PUC57，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；所述阴性对照为TE缓冲液。
7.一种快速检测惠普尔养障体的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
8.根据权利要求7所述快速检测惠普尔养障体的方法，其特征在于，所述待检测样本类型为痰液、肺泡灌洗液、脑脊液或口咽拭子。
9.权利要求1-6任一项荧光PCR试剂盒在检测惠普尔养障体中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增引物、荧光探针、pcr检测试剂、阳性对照、阴性对照和无酶水。
2.根据权利要求1所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表seq idno.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；所述荧光探针的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示。
3.根据权利要求2所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述正向引物和反向引物的工作浓度均为0.1-1.0μm，荧光探针的工作浓度均为0.1-1.0μm，优选的，所述正向引物和反向引物的工作浓度为0.25-0.5μm，荧光探针的工作浓度为0.25-0.5μm。
4.根据权利要求1所述用于快速检测惠普尔养障体的荧光pcr试剂盒，其特征在于，所述荧光探针为taqman探针或taqman-mgb探针，荧光探针的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团，其中修饰5’端的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶，刘秀梅，王亮，辛成齐，陈维功，王泽旭，
申请(专利权)人：大连干细胞与精准医学创新研究院，
类型：发明
国别省市：
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