基于ＳＣＡＲ分子标记快速检测溶藻弧菌的ＰＣＲ特异扩增引物及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于ＳＣＡＲ分子标记快速检测溶藻弧菌的ＰＣＲ特异扩增引物及检测试剂盒。上、下游引物的核苷酸序列为：上游引物ＶａＦ：５′－ＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣ－３′；下游引物ＶａＲ：５′－ＧＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣ－３′。试剂盒中包括用灭菌双蒸水溶解的ＰＣＲ特异扩增上游引物ＶａＦ和下游引物ＶａＲ的混合液，浓度为０．５－２μＭ。可用培养的弧菌菌落直接做ＰＣＲ反应进行检测，无需提取弧菌基因组ＤＮＡ，省时省力、简便、快速、准确、特异性好、灵敏度高。该试剂盒可用于海水养殖动物养殖过程中溶藻弧菌的跟踪检测及海水环境监测，具有很高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测海水养殖动物病原菌的PCR特异扩增引物及检测试剂盒，尤 其是一种检测准确性及灵敏性高、时间短、成本低的基于SCAR (Sequence characterized amplified region，特征性序列扩增区域)分子标记快速检测溶藻弧菌的PCR特异扩增引 物及检测试剂盒。
技术介绍
弧菌是海水养殖动物主要的条件致病菌，其中病原性弧菌能使养殖动物暴发性死 亡，与病毒、其他细菌或寄生虫等一起将会对海水养殖动物造成巨大的损害，被公认为是海 水养殖中最为严重的病害之一。如溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)可导致鱼、虾、贝、海 参等养殖动物大规模死亡，也给误食感染了溶藻弧菌食物的人类健康带来隐患。目前，对 弧菌的检测方法有生理生化鉴定技术、酶联免疫吸附试验、16S rRNA基因鉴定等，分别存在 如下不足生理生化鉴定技术耗时费力，检测的准确率低；酶联免疫吸附试验敏感性不高； 16S rRNA基因鉴定只能将致病弧菌鉴定到属，而无法鉴定到种。
技术实现思路
本专利技术是针对现有技术所存在的上述技术问题，提供一种检测准确性及灵敏性 高、时间短、成本低的基于SCAR分子标记快速检测溶藻弧菌的PCR特异扩增引物及检测试剂盒。本专利技术的技术解决方案是一种基于SCAR分子标记快速检测溶藻弧菌的PCR特异 扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VaF 5 ‘ -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 ‘；下游引物VaR 5 ‘ -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 ‘。—种基于SCAR分子标记快速检测溶藻弧菌的检测试剂盒，其特征在于包含如下 试剂试剂I 用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物VaF和下游引 物VaR的混合液，浓度为0. 5-2 μ M，上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VaF 5' -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3‘；下游引物 VaR:5' -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3‘；试剂II :dNTPs四种脱氧核苷酸的混合液，浓度为50 500 μ M ；试剂III :10XPCR 缓冲液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 和 16mM 二硫苏糖醇；试剂IV =Taq DNA聚合酶，浓度为5U/μ 1 ；试剂V:灭菌双蒸水；试剂VI 作为阳性模板的溶藻弧菌的总DNA，浓度为50ng/y 1 ；试剂VII 含有IX上样缓冲液的DL2000DNA分子量，浓度为50ng/y 1。本专利技术是利用RAPD (Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA) 技术在各种弧菌中进行分析，发现了溶藻弧菌的差异特异性DNA片段，将差异特异性DNA片 段回收测序，然后再根据测得的序列设计及合成了用于检测溶藻弧菌的PCR特异扩增上下 游引物、检测试剂盒，可用培养的弧菌菌落直接做PCR反应进行检测，无需提取弧菌基因组 DNA，省时省力、简便、快速、准确、特异性好、灵敏度高。可用于海水养殖动物养殖过程中溶 藻弧菌的跟踪检测及海水环境监测，具有很高的实用价值。附图说明图1是用本专利技术实施例检测患腹水病的牙鲆肝脏病灶的结果示意图。 具体实施例方式本专利技术实施例是利用200多条RAPD引物在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) (ATCC 17749)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus) (ATCC 27562)、副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus) (ATCC 17802)、河弧菌(Vibrio fluvialis) (ATCC 33810)、最 小弧菌(Vibrio mimicus) (ATCC 33653)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi) (ATCC33842)、坎氏弧 菌(Vibrio campbellii) (ATCC 33864)和鲨鱼弧菌(Vibriocarchariae) (ATCC 35084)等 弧菌上开发并转化为溶藻弧菌的种属特异性SCAR标记，其核苷酸序列为GAGAAGCGGGTGCATTGAACGCTGAACTGGTCGTGATATAAGGAGTTAAGGATGAAGCTAGACAGTACC AATGAACAAGCTCAGTTAAATTCGATGCTTTATCACGACAATAGTGCATTGGCTAACATCAAGCATAGTCGTGATCA AGAAGGCGCACTTGAAGTCGTCGCAGGTCAATTTGAGGCAATGTTCCTACAAATGGTGTTACGCCAAATGCGCAGCA GTAGTGATGCTCTTGCTGATAAAGACAACCCGTTCGCCAGTCAGCAACAAGGGGTATTCCGTGATATGTATGACGGT CAGCTGGCGATGGAATTAGCAAAGAAACAGAGCTCAGGCATTGCCAATATGCTCATCCAGCAGCTGAGCCCGTCTAT GCGTGAGGTTGCTTTCGATGCTGCGCGCAACATCTCATCCGCTAACGATGGTAAAGCTTCGAATTCTGAATCTATCT CACAAGTAGATTCTAAAGAGGTGGAGAAGAATTCAAGCC。本专利技术实施例是根据上述特异性SCAR标记，设计并合成了快速检测溶藻弧菌的 PCR特异扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VaF 5 ‘ -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 ‘；下游引物VaR :5, -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 ‘。本专利技术所设计的检测试剂盒含有如下试剂试剂I 用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物 VaF (5 ‘ -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 ‘)和下游弓丨物 VaR (5 ‘ -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 ‘)的混合液，浓度为0.5-2μΜ;试剂II :dNTPs四种脱氧核苷酸的混合液，浓度为50 500 μ M ；试剂III :10XPCR 缓冲液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 禾口 16mM 二硫苏糖醇(DTT)；试剂IV =Taq DNA聚合酶，浓度为5U/ μ 1 ；试剂V 灭菌双蒸水(ddH20)；试剂VI 作为阳性模板的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) (ATCC 17749)的总 DNA，浓度为 50ng/ μ 1 ；4试剂VII 含有IX上样缓冲液的DL2000 DNA分子量，浓度为50ng/y 1。用本专利技术实施例检测患腹水病的牙鲆肝脏病灶致病性溶藻弧菌，按下述步骤进 行(1)在超净工作台上用接菌环刮取患腹水病的牙鲆肝脏病灶，在2216E培养基 上划线接菌，28°C培养10 12小时，当细菌菌落的直径在1 1. 5mm左右时可直接用于 SCAR-PCR 反应；(2)在 200 μ 1 PCR 反应管中放 1μ 1试剂 Ι、2μ 1 试剂 ΙΙ、2· 5μ 1试剂 ΙΙΙ、0· 5μ 1 试剂IV及19 μ 1试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于ＳＣＡＲ分子标记快速检测溶藻弧菌的ＰＣＲ特异扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为：　　上游引物ＶａＦ：５′－ＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣ－３′；　　下游引物ＶａＲ：５′－ＧＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣ－３′。

【技术特征摘要】
一种基于SCAR分子标记快速检测溶藻弧菌的PCR特异扩增引物，其特征在于上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VaF5′ GAGAAGCGGGTGCATTGAAC 3′；下游引物VaR5′ GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC 3′。2.一种基于SCAR分子标记快速检测溶藻弧菌的检测试剂盒，其特征在于包含如下试剂试剂I 用灭菌双蒸水溶解的PCR特异扩增上游引物VaF和下游引物VaR 的混合液，浓度为0. 5-2 uM,上、下游引物的核苷酸序列为上游引物VaF 5 ‘ -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 ‘；下游引物 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀利，田春雨，常亚青，仇雪梅，
申请(专利权)人：大连水产学院，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]