【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及一种基于rt-lamp和crispr/cas12a的猪塞内卡病毒可视化检测方法。
技术介绍
1、塞内卡病毒(senecavirusa，sva)是一种新发现的小型单股正链型rna病毒，属于小rna病毒科，塞内卡病毒属，其病毒粒子呈典型的二十面体对称，直径约为22～27nm。2002年，科学家首次从人类的胚胎视网膜细胞培养物中分离获得该病毒。因该病毒能特异靶向神经分泌细胞，具有溶瘤作用，所以，早期被用于抗肿瘤治疗研究。研究表明，该病毒可以感染不同年龄段的猪，临床症状主要表现为吻突部、皮肤、口腔粘膜和蹄部出现严重水泡甚至溃疡，新生仔猪死亡率最高。其特点与口蹄疫(foot andmouth disease，fmd)、猪水疱病(swine vesicular disease，svd)、水疱性口炎病(vesicular stomatitis，vs)等疾病相似，常常混合感染，这使得临床鉴别诊断变得困难。
2、目前，研究人员，已将pcr、rt-pcr、rt-qpcr以及elisa等方法用于sva实验室检测。然而，这些方法耗时较长，需要复杂的仪器设备、实验室环境及专业的操作人员，尤其不适用于临床环境检测。因此，迫切需要一种便捷、灵敏性高、特异性强、可视化的sva检测方法，以便进行有效的病毒监测和流行病学调查。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种便捷、灵敏性高、特异性强、可视化的sva检测方法，本专利技术提供的方法不仅特异性强、灵敏性高，而且
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种猪塞内卡病毒可视化检测方法，所述方法包括：提取样品rna进行rt-lamp扩增，将扩增产物进行cas12a切割反应，反应后对报告分子进行检测；所述切割反应的体系包括：cas12a、crrna、ssdna报告分子和缓冲液，所述crrna为seq id no.11-13所示的序列之一；
4、优选的，所述crrna为seq id no.11所示的序列。
5、优选的，所述rt-lamp扩增的反应体系中的引物包括：f3和b3，fip和bip，lf和lr，其序列为seq id no.1-6所示。
6、优选的，rt-lamp扩增反应的反应温度为50～65℃。
7、优选的，rt-lamp扩增反应的反应时间为15～60min。
8、优选的，rt-lamp扩增反应体系中包括mg2+，mg2+浓度为3～10mm。
9、优选的，rt-lamp扩增反应结束后，80℃加热3min。
10、本专利技术所述检测方法中ssdna报告分子为ssdna荧光报告分子，所述ssdna荧光报告分子为：5′-fam-ttatt-bhqi-3′。
11、优选的，ssdna荧光报告分子的浓度为50～1000nm。
12、优选的，cas12a为lbcas12a，crrna与lbcas12a的浓度均为25～250nm，。
13、优选的，反应温度4～42℃，反应时间为15min-35min。
14、本专利技术所述检测方法中ssdna报告分子为ssdna生物素报告分子，所述ssdna生物素报告分子为：5′-fam-tttttttattttttt-biotin-3′。
15、优选的，所述ssdna探针浓度为5～50nm，反应时间为10～35min，孵育时间为5～min。
16、本专利技术还提供了上述方法在检测猪塞内卡病毒中的应用。
17、有益效果
18、本专利技术基于lamp和crispr/cas12a技术，建立了sva检测方法，通过荧光法和试纸条法两种报告信号判别结果。实施例结果显示，该检测方法不与fmdv、csfv、pedv、pcv2和prrsv出现非特异交叉反应，crispr/cas12a结合rt-lamp扩增最低检测限为9.6copise/μl，和rt-qpcr检测最低限一致，表明本专利技术建立的方法特异性强、灵敏性高。
19、本专利技术建立了2步检测方法。第一步，提取样品rna，进行rt-lamp扩增，在65℃的恒温条件45min即可完成扩增。第二步，配制crispr/cas12a检测体系，若体系中是荧光报告分子，37℃反应15min，紫外光照射可观察结果。若体系中是生物素报告分子，37℃反应15min后，试纸条检测5min，肉眼可观察到结果。整个检测过程不超过1.5h，与pcr检测相比，大大节省了检测时间且不需要特殊仪器。本专利技术还发现crispr/cas12a反应，并不需要37℃，室温10-30℃就可以满足实验要求，这使得建立的方法更贴近基层临床检测。
20、本专利技术所述方法在rt-lamp扩增结束后，80℃加热3min，使bst 4.0dna/rnapolymerase酶完全失活，避免了开盖气溶胶污染，取得良好的效果。
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1.一种猪塞内卡病毒可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括：提取样品RNA进行RT-LAMP扩增，将扩增产物进行Cas12a切割反应，反应后对报告分子进行检测；所述切割反应的体系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA报告分子和缓冲液，所述crRNA为SEQ ID No.11-13所示的序列之一。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增的反应体系中的引物包括：F3和B3，FIP和BIP，LF和LR，其序列为SEQ ID No.1-6所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增反应的反应温度为50～65℃，反应时间为15～60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-LAMP扩增反应结束后，80℃加热3min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssDNA报告分子为ssDNA荧光报告分子，所述ssDNA荧光报告分子为：5′-FAM-TTATT-BHQI-3′。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas12a为LbCas12
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Cas12a切割反应的反应温度为4～42℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ssDNA报告分子为ssDNA生物素报告分子，所述ssDNA生物素报告分子为：5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin-3′。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ssDNA探针浓度为5～50nM，反应时间为10～35min，孵育时间为5～min。
10.权利要求1-9任一项所述方法在检测猪塞内卡病毒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种猪塞内卡病毒可视化检测方法，其特征在于，所述方法包括：提取样品rna进行rt-lamp扩增，将扩增产物进行cas12a切割反应，反应后对报告分子进行检测；所述切割反应的体系包括：cas12a、crrna、ssdna报告分子和缓冲液，所述crrna为seq id no.11-13所示的序列之一。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rt-lamp扩增的反应体系中的引物包括：f3和b3，fip和bip，lf和lr，其序列为seq id no.1-6所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rt-lamp扩增反应的反应温度为50～65℃，反应时间为15～60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rt-lamp扩增反应结束后，80℃加热3min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋成辉，常艳燕，郭容霞，王会宝，杨锐，李小明，刘萍，王晶，杨进才，
申请(专利权)人：中农威特生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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