【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、口唇疱疹属于单纯疱疹的一种，单纯疱疹是单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，hsv)引起的皮肤和黏膜疾病。hsv的天然宿主是人，侵入人体可引起全身性损害及多种皮肤黏膜疾病。口腔、皮肤、眼、会阴、中枢神经等都是该病毒易于侵犯的部位，当病变以口唇部位为主时成为口唇疱疹。
2、口唇疱疹一般采用口服抗病毒药物进行治疗，也可以配合抗生素糊剂进行局部涂抹，可能会产生其它副作用。
3、外泌体是一类30nm-150nm左右的脂质体囊泡，其可将包裹的小分子脂类、多肽、蛋白以及小分子核酸等活性物质进行细胞间传递，实现细胞间信息交换。由于外泌体具有强大的生物活性和细胞功能，现在已被作为一种无细胞治疗方案受到研究者的广泛关注。大量研究表明，脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫原性低，具有强大的组织修复和免疫调节作用，同时安全性更高。因此，脐带间充质干细胞来源的外泌体在治疗免疫相关炎症性疾病方面具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
3、(1)脐带处理：将脐带剪成若干小段并洗涤，然后撕取华通氏胶并充分剪碎，离心洗涤后接种于培养瓶进行培养；
4、
5、(3)细胞传代：弃去培养瓶中的培养基和组织块，洗涤，加入胰酶，离心弃上清，将细胞接种至新的培养瓶继续培养，传代多次；
6、(4)间充质干细胞制备：取第6代培养瓶弃去培养基和组织块，洗涤，加入胰酶，离心弃上清，加入干细胞冻存液重悬，得到间充质干细胞悬液；
7、(5)脐带间充质干细胞外泌体制备：取间充质干细胞悬液离心，弃上清后接种于新的培养瓶进行培养，当细胞贴壁生长程度大于70％后，弃去上清，加入培养基继续培养，收集上清得到脐带间充质干细胞外泌体原液；
8、(6)外泌体原液纯化浓缩：将脐带间充质干细胞外泌体原液依次经真空抽滤，切向流过滤膜包浓缩，再次真空过滤，得到脐带间充质干细胞外泌体纯化浓缩液。
9、优选的，所述步骤(1)具体包括如下步骤：
10、(1.1)取六支离心管，其中三支离心管中分别加入含1％双抗的0.9％生理盐水，另外三支离心管中分别加入不含双抗的0.9％生理盐水；
11、(1.2)取出脐带至培养皿中，并剪成若干小段，先放入含双抗的0.9％生理盐水的离心管中充分洗涤，然后放入不含双抗的0.9％生理盐水的离心管中充分洗涤；
12、(1.3)取洗涤后的脐带放入新的培养皿中，去除动脉和静脉，撕取华通氏胶并充分剪碎；
13、(1.4)加入不含双抗的0.9％生理盐水并移至新的离心管中，离心洗涤2次；
14、(1.5)将剪碎的华通氏胶平分至多个已加入原代细胞培养基的t175培养瓶中，标记好细胞名称和操作日期；
15、(1.6)平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放到培养箱中培养。
16、优选的，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
17、(2.1)每5-7天弃去培养瓶中部分培养基，加入新培养基；
18、(2.2)平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放到培养箱中培养；
19、(2.3)每2-3天观察细胞生长情况，待有细胞爬出后，在长出位置做好标记，出现叠层细胞后进行冻存并建立细胞种子库。
20、优选的，所述步骤(3)具体包括如下步骤：
21、(3.1)弃去培养瓶中的培养基和组织块，加入0.9％生理盐水洗涤两次。
22、(3.2)加入胰酶，静置，镜下观察，当观察到细胞变圆、透亮，细胞间隙明显增大时，加入培养基终止消化；
23、(3.3)用移液管轻柔吹打，保证培养瓶底部的每个角落都吹打完全，吹打时尽量防止产生气泡；
24、(3.4)吹打结束后，用移液管吸至离心管中，离心；
25、(3.5)弃上清，加入0.9％生理盐水取样计数，细胞计数完毕后离心；
26、(3.6)弃上清，加入新培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶中成团，影响细胞生长；
27、(3.7)将细胞接种至t175瓶，标记细胞名称、代数和操作日期；
28、(3.8)平置培养瓶使细胞尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放到培养箱中培养。
29、优选的，所述步骤(4)具体包括如下步骤：
30、(4.1)取第6代培养瓶弃除培养瓶中的培养基和组织块，加入0.9％生理盐水洗涤两次；
31、(4.2)加入胰酶，静置，镜下观察，当观察到细胞变圆、透亮，细胞间隙明显增大时，加入培养基终止消化；
32、(4.3)用移液管轻柔吹打，保证培养瓶底部的每个角落都吹打完全，吹打时尽量防止产生气泡；
33、(4.4)吹打结束后，用移液管吸至离心管中，离心；
34、(4.5)弃上清，加入0.9％生理盐水取样计数，细胞计数完毕后离心；
35、(4.6)弃上清，加入干细胞冻存液重悬细胞，得到间充质干细胞悬液；
36、(4.7)取多个冻存管，每个冻存管加入1ml间充质干细胞悬液，并贴上对应标签；
37、(4.8)将冻存管放入程序降温盒中放进-80℃冰箱冷冻24h，然后移至-196℃液氮罐中长期保存。
38、优选的，所述步骤(5)具体包括如下步骤：
39、(5.1)从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃的水浴锅中快速解冻，同时不断轻轻的摇动冻存管，保证冻存管里的细胞1min中内融化，用75％的酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台；
40、(5.2)用移液管将间充质干细胞悬液转移至已装有培养基的离心管中，离心；
41、(5.3)弃上清，加入新培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶中成团，影响细胞生长；
42、(5.4)将细胞接种至t175瓶，标记细胞名称、代数和操作日期；
43、(5.5)平置培养瓶使细胞尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放到培养箱中培养2-3天；
44、(5.6)显微镜下观察细胞生长状态，细胞贴壁生长程度大于70％后，弃去上清，生理盐水洗两遍，加入1640培养基，继续培养72h，收集上清得到脐带间充质干细胞外泌体原液。
45、优选的，所述步骤(6)具体包括如下步骤：
46、(6.1)用孔径为0.45μm的真空抽滤杯过滤，初步去除细胞碎片杂质；
47、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(1)具体包括如下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(2)具体包括如下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(3)具体包括如下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(4)具体包括如下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(5)具体包括如下步骤：
7.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(6)具体包括如下步骤：
8.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述脐带间充质干细胞外泌体根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得。
9.如权利要求8所述的一种脐带间充质干细胞外泌体在制备治疗口唇疱疹的药物中的应用。
10.一种治疗口唇疱疹的药物
...【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(1)具体包括如下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(2)具体包括如下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(3)具体包括如下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：所述步骤(4)具体包括如下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种脐带...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟柏茂，陆小梅，朱英华，彭琪，
申请(专利权)人：东莞市第八人民医院东莞市儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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