【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本披露提供了将目的多核苷酸插入真核细胞的基因组中的方法，其中所述方法包括通过向该真核细胞添加微同源介导的末端连接(mmej)途径的抑制剂来提高crispr/cas介导的多核苷酸插入的效率。本披露进一步提供了用于将目的多核苷酸插入真核细胞的基因组中的组合物，以及用于将目的基因插入真核细胞的基因组中的试剂盒。
技术介绍
1、开发用于精确靶向改变活细胞的基因组的经济有效且可靠的方法已成为长期目标。基因组编辑具有消除造成特定病症的基因(即基因“敲除”)的潜力，或者替代性地提供用于基因操纵或插入的手段以经由基因“敲入”纠正遗传缺陷或增强生物过程。基因组编辑可适用于治疗多种病症，包括治疗遗传性病症、血液病症和癌症，并且可适用于免疫治疗方法。
2、成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)系统是由ishino在大肠杆菌(e.coli)中首次发现的原核生物免疫系统(ishino等人,journalofbacteriology[细菌学杂志]169(12):5429-5433(1987))。该原核生物免疫系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸来提供针对病毒和质粒的免疫。还参见soret等人,nature reviews microbiology[自然综述微生物学]6(3):181-186(2008)。
3、自最初发现以来，多个研究小组围绕crispr系统在基因工程中的潜在应用进行了大量的研究，包括基因编辑(jinek等人,science[科学]337(6096):816-821(2012
4、cas9核酸内切酶在前间区序列邻近基序(pam)上游在靶序列处产生双链dna断裂。然后可以去除靶序列，或者可以使用细胞的内源修复途径将目的序列插入靶序列中。内源dna修复途径包括非同源末端连接(nhej)途径、微同源介导的末端连接(mmej)途径和同源定向修复(hdr)途径。nhej、mmej和hdr途径修复双链dna断裂，但这样的双链dna断裂的修复可在双链断裂位点引起插入或缺失。在nhej中，修复dna中的断裂不需要同源模板。nhej修复可能容易出错，但是当dna断裂包括相容的突出端时，错误会减少。nhej和mmej是在机理上截然不同的dna修复途径，它们各自涉及dna修复酶的不同子集。与在一些情况下可能精确或在一些情况下容易出错的nhej不同，mmej总是容易出错，并且会导致在修复位点处的缺失和插入。mmej相关的缺失归因于双链断裂两侧的微同源性(2-10个碱基对)。相比之下，hdr需要同源模板来直接进行修复，但是hdr修复典型地具有高保真度，并且不易出错。因此，双链dna断裂的hdr驱动的修复优选于nhej或mmej介导的修复；然而，在许多细胞类型中，hdr受所有细胞周期阶段的nhej活性的限制，并且hdr主要用于细胞生长的s期(mao等人，cell cycle[细胞周期],7:2902-2906(2008))。
技术实现思路
1、在一些实施例中，本披露涉及增加crispr/cas介导的基因插入的效率的方法。在一些实施例中，该方法包括将目的多核苷酸插入真核细胞的基因组中，该方法包括(a)将mmej途径的抑制剂添加到包含真核细胞的组合物中，(b)将cas效应蛋白添加到该组合物中，以及(c)将目的多核苷酸添加到该组合物中，其中该目的多核苷酸通过同源定向修复(hdr)或单链模板修复(sstr)插入真核细胞的基因组中。
2、在一些实施例中，该方法的步骤(a)进一步包括添加非同源末端连接(nhej)途径的抑制剂。
3、在一些实施例中，该方法进一步包括(d)将包含rna指导序列、cas结合区、dna模板序列或其组合的多核苷酸添加到该组合物中。
4、在一些实施例中，该cas效应蛋白和(d)的该多核苷酸以核糖核蛋白(rnp)的形式添加。
5、在一些实施例中，在(b)中通过添加编码该cas效应蛋白的cas多核苷酸来添加该cas效应蛋白。
6、在一些实施例中，在单个载体上编码该目的多核苷酸、步骤(d)的该多核苷酸和该cas多核苷酸。在一些实施例中，该目的多核苷酸作为dna添加。在一些实施例中，步骤(d)的该多核苷酸作为dna添加。在一些实施例中，步骤(d)的该多核苷酸作为rna添加。在一些实施例中，该cas效应多核苷酸作为dna添加。在一些实施例中，该cas多核苷酸作为rna添加。在一些实施例中，该cas多核苷酸作为mrna添加。
7、在一些实施例中，该载体是病毒载体。在一些实施例中，该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(aav)。
8、在一些实施例中，该cas效应蛋白、该目的多核苷酸和(d)的该多核苷酸通过显微注射、电穿孔，或经由脂质纳米颗粒、脂质体、外来体、金纳米颗粒或dna纳米线团(nanoclew)添加到该真核细胞中。
9、在一些实施例中，通过转染真核细胞将载体添加到包含真核细胞的组合物中。
10、在一些实施例中，该cas效应蛋白是cas9核酸酶、cas12a核酸酶或cas12f核酸酶。在一些实施例中，该cas效应蛋白是cas9核酸酶。在一些实施例中，该cas9核酸酶是与逆转录酶融合的cas9核酸酶、与dna聚合酶融合的cas9核酸酶、与dn1s融合的cas9核酸酶、cas9切口酶、与geminin降解决定子(degron)结构域融合的cas9或与ctip融合的cas9核酸酶。
11、在一些实施例中，该目的多核苷酸经由载体添加。在一些实施例中，该载体是病毒载体。在一些实施例中，该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(aav)。
12、在一些实施例中，该目的多核苷酸包含目的基因。在一些实施例中，该目的多核苷酸的长度为1至50个碱基对。在一些实施例中，该目的多核苷酸的长度为1至10个碱基对。在一些实施例中，该目的多核苷酸的长度为50至5000个碱基对。
13、在一些实施例中，该目的多核苷酸是单链的。在一些实施例中，该目的多核苷酸是双链的。在一些实施例中，该目的多核苷酸是包含单链区和双链区的杂合多核苷酸。在一些实施例中，该杂合多核苷酸包含5'端和3'端的双链序列以及内部单链序列。在一些实施例中，该目的多核苷酸是具有平末端的双链。在一些实施例中，该目的多核苷酸是具有3'突出端的双链。在一些实施例中，该目的多核苷酸是具有5'突出端的双链。在一些实施例中，该目的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种将目的多核苷酸插入真核细胞的基因组中的方法，该方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中(a)进一步包括添加非同源末端连接(NHEJ)途径的抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，该方法进一步包括：(d)将多核苷酸添加到该组合物中，该多核苷酸包含：RNA指导序列；Cas结合区；DNA模板序列，或其组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在(b)中通过添加编码该Cas效应蛋白的Cas多核苷酸来添加该Cas效应蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在载体上编码(i)该目的多核苷酸、(ii)(d)的该多核苷酸或(iii)该Cas多核苷酸中的一种或多种。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在单个载体上编码(i)该目的多核苷酸、(ii)步骤(d)的该多核苷酸和(iii)该Cas多核苷酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸作为DNA添加。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(d)的该多核苷酸作为DNA添加。
9
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该Cas效应多核苷酸作为DNA添加。
11.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该Cas多核苷酸作为RNA添加。
12.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该Cas多核苷酸作为mRNA添加。
13.如权利要求5或6所述的方法，其中该载体是病毒载体。
14.如权利要求13所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)。
15.如权利要求3所述的方法，其中该Cas效应蛋白和(d)的该多核苷酸以核糖核蛋白(RNP)的形式添加。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该Cas效应蛋白、该目的多核苷酸和(d)的该多核苷酸通过显微注射、电穿孔，或经由脂质纳米颗粒、脂质体、外来体、金纳米颗粒或DNA纳米线团添加到该细胞中。
17.如权利要求5或9所述的方法，其中通过转染该真核细胞将该载体添加到该组合物中。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该Cas效应蛋白是Cas9核酸酶、Cas12a核酸酶或Cas12f核酸酶。
19.如权利要求18所述的方法，其中该Cas效应蛋白是Cas9核酸酶。
20.如权利要求19所述的方法，其中该Cas9核酸酶是与逆转录酶融合的Cas9核酸酶、与DNA聚合酶融合的Cas9核酸酶、与DN1S融合的Cas9核酸酶、Cas9切口酶、与Geminin降解决定子结构域融合的Cas9或与CTIP融合的Cas9核酸酶。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸经由载体添加。
22.如权利要求21所述的方法，其中该载体是病毒载体。
23.如权利要求22所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸包含目的基因。
25.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸的长度为1至50个碱基对。
26.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸的长度为50至5000个碱基对。
27.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是单链的。
28.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是双链的。
29.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是包含单链区和双链区的杂合多核苷酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中该杂合多核苷酸包含5'端和3'端的双链序列以及内部单链序列。
31.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是具有平末端的双链。
32.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是具有3'突出端的双链。
33.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是具有5'突出端的双链。
34.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是环状多核苷酸。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸包含增强该多核苷酸的稳定性、活性、分布或摄取的化学修饰。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种将目的多核苷酸插入真核细胞的基因组中的方法，该方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中(a)进一步包括添加非同源末端连接(nhej)途径的抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，该方法进一步包括：(d)将多核苷酸添加到该组合物中，该多核苷酸包含：rna指导序列；cas结合区；dna模板序列，或其组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在(b)中通过添加编码该cas效应蛋白的cas多核苷酸来添加该cas效应蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在载体上编码(i)该目的多核苷酸、(ii)(d)的该多核苷酸或(iii)该cas多核苷酸中的一种或多种。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在单个载体上编码(i)该目的多核苷酸、(ii)步骤(d)的该多核苷酸和(iii)该cas多核苷酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸作为dna添加。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(d)的该多核苷酸作为dna添加。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(d)的该多核苷酸作为rna添加。
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该cas效应多核苷酸作为dna添加。
11.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该cas多核苷酸作为rna添加。
12.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该cas多核苷酸作为mrna添加。
13.如权利要求5或6所述的方法，其中该载体是病毒载体。
14.如权利要求13所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(aav)。
15.如权利要求3所述的方法，其中该cas效应蛋白和(d)的该多核苷酸以核糖核蛋白(rnp)的形式添加。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该cas效应蛋白、该目的多核苷酸和(d)的该多核苷酸通过显微注射、电穿孔，或经由脂质纳米颗粒、脂质体、外来体、金纳米颗粒或dna纳米线团添加到该细胞中。
17.如权利要求5或9所述的方法，其中通过转染该真核细胞将该载体添加到该组合物中。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该cas效应蛋白是cas9核酸酶、cas12a核酸酶或cas12f核酸酶。
19.如权利要求18所述的方法，其中该cas效应蛋白是cas9核酸酶。
20.如权利要求19所述的方法，其中该cas9核酸酶是与逆转录酶融合的cas9核酸酶、与dna聚合酶融合的cas9核酸酶、与dn1s融合的cas9核酸酶、cas9切口酶、与geminin降解决定子结构域融合的cas9或与ctip融合的cas9核酸酶。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸经由载体添加。
22.如权利要求21所述的方法，其中该载体是病毒载体。
23.如权利要求22所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(aav)。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸包含目的基因。
25.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸的长度为1至50个碱基对。
26.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸的长度为50至5000个碱基对。
27.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是单链的。
28.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是双链的。
29.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是包含单链区和双链区的杂合多核苷酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中该杂合多核苷酸包含5'端和3'端的双链序列以及内部单链序列。
31.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是具有平末端的双链。
32.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是具有3'突出端的双链。
33.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是具有5'突出端的双链。
34.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸是环状多核苷酸。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸包含增强该多核苷酸的稳定性、活性、分布或摄取的化学修饰。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中该mmej途径的抑制剂是polq抑制剂。
37.如权利要求36所述的方法，其中该polq抑制剂是polq_1、polq_2、polq_3、polq_4、polq_5、polq_6、polq_7或其组合。
38.如权利要求36所述的方法，其中该polq抑制剂是肽。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中该组合物中该mmej途径的抑制剂的浓度为约0.01μm至约1mm。
40.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中该组合物中该mmej途径的抑制剂的浓度为约0.1μm至约100μm。
41.如权利要求2-38中任一项所述的方法，其中该nhej途径的抑制剂是dna依赖性蛋白激酶(dna-pk)的抑制剂。
42.如权利要求41所述的方法，其中该dna-pk的抑制剂是m3814、m9831/vx984、nu7441、nu7026、ku0060648、azd7648或其组合。
43.如权利要求42所述的方法，其中该dna-pk的抑制剂是azd7648。
44.如权利要求41所述的方法，其中该dna-pk的抑制剂是肽。
45.如权利要求2-44中任一项所述的方法，其中该组合物中该nhej途径的抑制剂的浓度为约0.01μm至约1mm。
46.如权利要求2-44中任一项所述的方法，其中该组合物中该nhej途径的抑制剂的浓度为约0.1μm至约100μm。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之前0分钟至约48小时将该mmej途径的抑制剂添加到该组合物中。
48.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之前0分钟至约24小时将该mmej途径的抑制剂添加到该组合物中。
49.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之前0分钟至约6小时将该mmej途径的抑制剂添加到该组合物中。
50.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之后0分钟至约1小时将该mmej途径的抑制剂添加到该组合物中。
51.如权利要求2-50中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之前0分钟至约48小时将该nhej途径的抑制剂添加到该组合物中。
52.如权利要求2-50中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之前0分钟至约24小时将该nhej途径的抑制剂添加到该组合物中。
53.如权利要求2-50中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之前0分钟至约6小时将该nhej途径的抑制剂添加到该组合物中。
54.如权利要求2-50中任一项所述的方法，其中在将该cas效应蛋白添加到该组合物中之后0分钟至约1小时将该nhej途径的抑制剂添加到该组合物中。
55.如权利要求2-54中任一项所述的方法，其中在同一时间将该mmej途径的抑制剂和该nhej途径的抑制剂添加到该组合物中。
56.如权利要求2-54中任一项所述的方法，其中在不同时间将该mmej途径的抑制剂和该nhej途径的抑制剂添加到该组合物中。
57.如权利要求2-54中任一项所述的方法，其中在同一时间将该mmej途径的抑制剂、该nhej途径的抑制剂和该cas效应蛋白添加到该组合物中。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中该mmej途径的抑制剂处于该组合物中约1小时至约300小时。
59.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中该mmej途径的抑制剂处于该组合物中约10小时至约100小时。
60.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中将该mmej途径的抑制剂至少添加一次、至少添加两次或至少添加三次。
61.如权利要求2-60中任一项所述的方法，其中该nhej途径的抑制剂处于该组合物中约1小时至约300小时。
62.如权利要求2-60中任一项所述的方法，其中该nhej途径的抑制剂处于该组合物中约10小时至约100小时。
63.如权利要求2-60中任一项所述的方法，其中将该nhej途径的抑制剂至少添加一次、至少添加两次或至少添加三次。
64.如权利要求1-63中任一项所述的方法，其中包含这些真核细胞的该组合物是细胞培养物。
65.如权利要求64所述的方法，其中该细胞培养物是体外细胞培养物或离体细胞培养物。
66.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其中该真核细胞是体内的。
67.如权利要求64所述的方法，其中该细胞培养物包含细胞提取物。
68.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中该真核细胞是淋巴细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中该淋巴细胞包含嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。
70.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中该真核细胞是多能干细胞。
71.如权利要求70所述的方法，其中该多能干细胞是诱导多能干细胞。
72.如权利要求64所述的方法，其中该细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。
73.一种将目的多核苷酸插入真核细胞的基因组中的方法，该方法包括：
74.如权利要求73所述的方法，其中(a)进一步包括将非同源末端连接(nhej)途径的抑制剂添加到该组合物中。
75.如权利要求73或74所述的方法，该方法进一步包括：(c)将多核苷酸添加到该组合物中，该多核苷酸包含：rna指导序列；cas结合区；dna模板序列，或其组合。
76.如权利要求75所述的方法，其中在载体上编码(i)该目的多核苷酸和(ii)(c)的该多核苷酸。
77.如权利要求73-76中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸作为dna添加。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其中(c)的该多核苷酸作为dna添加。
79.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其中(c)的该多核苷酸作为rna添加。
80.如权利要求76所述的方法，其中该载体是病毒载体。
81.如权利要求80所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(aav)。
82.如权利要求76所述的方法，其中通过转染该真核细胞将该载体添加到该组合物中。
83.如权利要求73-82中任一项所述的方法，其中该基因组整合的cas多核苷酸是可诱导的。
84.如权利要求73-83中任一项所述的方法，其中该cas效应蛋白是cas9核酸酶、cas12a核酸酶或cas12f核酸酶。
85.如权利要求84所述的方法，其中该cas效应蛋白是cas9核酸酶。
86.如权利要求85所述的方法，其中该cas9核酸酶是与逆转录酶融合的cas9核酸酶、与dna聚合酶融合的cas9核酸酶、与dn1s融合的cas9核酸酶、cas9切口酶、与geminin降解决定子结构域融合的cas9或与ctip融合的cas9核酸酶。
87.如权利要求73-86中任一项所述的方法，其中该目的多核苷酸经由载体添加。
88.如权利要求87所述的方法，其中该载体是病毒载体。
89.如权利要求88所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒、慢病毒、腺病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·马雷斯卡，S·斯维科维奇，N·阿克拉普，S·温伯格，
申请(专利权)人：阿斯利康瑞典有限公司，
类型：发明
国别省市：
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