【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于发酵工程，具体涉及一株异亮氨酸高产菌株及其构建方法及其应用。
技术介绍
1、异亮氨酸是人体八种必须氨基酸之一，具有维持肝功能、肌肉功能、血液循环等多种生理功能，对人体健康具有重要的调节作用。此外，异亮氨酸对许多动物生长发育具有明显的促进作用。因此，异亮氨酸在医药、饲料、化妆品等领域应用广泛，市场前景广阔。
2、目前异亮氨酸的生产方法主要包括提取法、化学合成法、酶合成法和微生物发酵法。随着合成生物学的兴起，微生物发酵法因为低成本、效率高、绿色无污染等优势逐渐成为异亮氨酸合成的主要方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一株异亮氨酸高产菌株及其构建方法及其应用。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一株异亮氨酸高产菌株，所述异亮氨酸高产菌株为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)i1e-0，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2023年12月20日，菌种保藏编号为cgmcc no.29357。
3、优选的技术方案为：利用代谢工程改造方法对出发菌株谷氨酸棒杆菌atcc 13032进行改造获得，具体包括：在atcc 13032的基因组上过表达丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸转氨酶aspc、天冬氨酸激酶lysca279t、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrb、苏氨酸合酶thrc、苏氨酸脱水酶ilvav140m-
4、优选的技术方案为：过表达基因均由ptuf启动子启动，其中基因支链氨基酸转氨酶ilve、乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v拷贝数之比为2︰3︰2，即支链氨基酸转氨酶ilve基因为2拷贝、乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e基因为3拷贝、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v基因为2拷贝，其他过表达基因均为单拷贝。
5、优选的技术方案为：所述丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸激酶lysca279t、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrb、苏氨酸合酶thrc、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v、乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e、酮醇酸还原异构酶ilvc、支链氨基酸转氨酶ilve、亮氨酸响应调控因子lrp、支链氨基酸外排蛋白brnfe和支链氨基酸内转运蛋白brnq，均来源于谷氨酸棒杆菌；所述天冬氨酸转氨酶aspc来源于大肠杆菌；所述吡啶核苷酸转氢酶pntab来源于大肠杆菌。
6、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种异亮氨酸高产菌株的构建方法，包括：在出发菌株谷氨酸棒杆菌atcc 13032的基因组上的过表达基因丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸转氨酶aspc、天冬氨酸激酶lysca279t、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrb、苏氨酸合酶thrc、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v、乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e、酮醇酸还原异构酶ilvc、支链氨基酸转氨酶ilve、吡啶核苷酸转氢酶pntab、亮氨酸响应调控因子lrp和支链氨基酸外排蛋白brnfe，敲除基因支链氨基酸内转运蛋白brnq；所有过表达基因均由ptuf启动子启动，其中基因支链氨基酸转氨酶ilve、乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v拷贝数之比为2︰3︰2，其他过表达基因均为单拷贝；
7、在假基因位点ncg2001使用ptuf启动子控制丙酮酸羧化酶pyc过表达；
8、在假基因位点ncg2666使用ptuf启动子控制天冬氨酸转氨酶aspc过表达；
9、在假基因位点ncg1960使用ptuf启动子控制天冬氨酸激酶lysca279t过表达；
10、在假基因位点ncg2000使用ptuf启动子控制天冬氨酸半醛脱氢酶asd过表达；
11、在假基因位点ncg2037使用ptuf启动子控制高丝氨酸脱氢酶hom过表达；
12、在假基因位点ncg2425使用ptuf启动子控制高丝氨酸激酶thrb过表达；
13、在假基因位点ncg2441使用ptuf启动子控制苏氨酸合酶thrc过表达；
14、在假基因位点ncg1995使用ptuf启动子控制苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v过表达；
15、在假基因位点ncg2711使用ptuf启动子控制苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v过表达；
16、在假基因位点ncg2269使用ptuf启动子控制乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e过表达；
17、在假基因位点ncg1758使用ptuf启动子控制乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e过表达；
18、在假基因位点ncg2716使用ptuf启动子控制乙酰乳酸合酶ilvbn p176s-d426e过表达；
19、在假基因位点ncg2478使用ptuf启动子控制酮醇酸还原异构酶ilvc过表达；
20、在假基因位点ncg2673使用ptuf启动子控制支链氨基酸转氨酶ilve过表达；
21、在假基因位点ncg2758使用ptuf启动子控制支链氨基酸转氨酶ilve过表达；
22、在假基因位点ncg2546使用ptuf启动子控制吡啶核苷酸转氢酶pntab过表达；
23、在假基因位点ncg1448使用ptuf启动子控制亮氨酸响应调控因子lrp过表达；
24、在支链氨基酸内转运蛋白基因位点brnq使用ptuf启动子控制支链氨基酸外排蛋白brnfe过表达。
25、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：所述的异亮氨酸高产菌株在发酵制备异亮氨酸的应用。
26、优选的技术方案为：具体步骤如下：
27、(1)种子培养：在培养温度为35-39℃，通过自动流加体积分数为20-28％氨水溶液维持培养ph在7.0±0.1，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为45-55％，当od600nm为15时达到接种要求；
28、(2)发酵培养：接种量为20-30％，培养温度为35-39℃，通过自动流加体积分数为20-28％氨水溶液维持培养ph在7.0±0.1，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为45-55％，通过流加体积分数为70-85％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤1g/l，发酵周期≤40h。
29、优选的技术方案为：种子培养基：葡萄糖3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株异亮氨酸高产菌株，其特征在于：所述异亮氨酸高产菌株为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）I1e-0，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2023年12月20日，菌种保藏编号为CGMCC No.29357。
2.根据权利要求1所述的异亮氨酸高产菌株，其特征在于：利用代谢工程改造方法对出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032进行改造获得，具体包括：在ATCC 13032的基因组上过表达丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸转氨酶aspC、天冬氨酸激酶lysCA279T、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrB、苏氨酸合酶thrC、苏氨酸脱水酶ilvAV140M-F383V、乙酰乳酸合酶ilvBNP176S-D426E、酮醇酸还原异构酶ilvC、支链氨基酸转氨酶ilvE、吡啶核苷酸转氢酶pntAB、亮氨酸响应调控因子lrp和支链氨基酸外排蛋白brnFE，敲除基因支链氨基酸内转运蛋白brnQ。
3.根据权利要求2所述的异亮氨酸高产菌株，其特征在于：过表达基因均由Ptu
4.根据权利要求2所述的异亮氨酸高产菌株，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸激酶lysCA279T、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrB、苏氨酸合酶thrC、苏氨酸脱水酶ilvAV140M-F383V、乙酰乳酸合酶ilvBNP176S-D426E、酮醇酸还原异构酶ilvC、支链氨基酸转氨酶ilvE、亮氨酸响应调控因子lrp、支链氨基酸外排蛋白brnFE和支链氨基酸内转运蛋白brnQ，均来源于谷氨酸棒杆菌；所述天冬氨酸转氨酶aspC来源于大肠杆菌；所述吡啶核苷酸转氢酶pntAB来源于大肠杆菌。
5.一种异亮氨酸高产菌株的构建方法，其特征在于：包括：在出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组上的过表达基因丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸转氨酶aspC、天冬氨酸激酶lysCA279T、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrB、苏氨酸合酶thrC、苏氨酸脱水酶ilvAV140M-F383V、乙酰乳酸合酶ilvBNP176S-D426E、酮醇酸还原异构酶ilvC、支链氨基酸转氨酶ilvE、吡啶核苷酸转氢酶pntAB、亮氨酸响应调控因子lrp和支链氨基酸外排蛋白brnFE，敲除基因支链氨基酸内转运蛋白brnQ；所有过表达基因均由Ptuf启动子启动，其中基因支链氨基酸转氨酶ilvE、乙酰乳酸合酶ilvBNP176S-D426E、苏氨酸脱水酶ilvAV140M-F383V拷贝数之比为2︰3︰2，其他过表达基因均为单拷贝；
6.权利要求1-4任一所述的异亮氨酸高产菌株在发酵制备异亮氨酸的应用。
7.根据权利要求6所述的亮氨酸生产菌株在发酵制备L-亮氨酸的应用，其特征在于：具体步骤如下：
8.根据权利要求6所述的亮氨酸生产菌株在发酵制备L-亮氨酸的应用，其特征在于：种子培养基：葡萄糖 30g/L，酵母提取物 6g/L，蛋白胨 2g/L，柠檬酸 2g/L，硫酸铵 2g/L，磷酸二氢钾 3g/L，七水合硫酸镁 2g/L，一水合硫酸锰 10 mg/L，谷氨酸 2g/L，蛋氨酸 0.5g/L。
9.根据权利要求6所述的亮氨酸生产菌株在发酵制备L-亮氨酸的应用，其特征在于：发酵培养基：葡萄糖 20g/L，酵母提取物 3g/L，玉米浆 20 mL/L蛋白胨 2g/L，柠檬酸 2g/L，硫酸铵 1g/L，磷酸二氢钾 6g/L，七水合硫酸镁 2g/L，七水合硫酸亚铁 40mg/L，一水合硫酸锰 10mg/L，生物素 1 mg/L。
...【技术特征摘要】
1.一株异亮氨酸高产菌株，其特征在于：所述异亮氨酸高产菌株为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）i1e-0，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏日期为2023年12月20日，菌种保藏编号为cgmcc no.29357。
2.根据权利要求1所述的异亮氨酸高产菌株，其特征在于：利用代谢工程改造方法对出发菌株谷氨酸棒杆菌atcc 13032进行改造获得，具体包括：在atcc 13032的基因组上过表达丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸转氨酶aspc、天冬氨酸激酶lysca279t、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrb、苏氨酸合酶thrc、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v、乙酰乳酸合酶ilvbnp176s-d426e、酮醇酸还原异构酶ilvc、支链氨基酸转氨酶ilve、吡啶核苷酸转氢酶pntab、亮氨酸响应调控因子lrp和支链氨基酸外排蛋白brnfe，敲除基因支链氨基酸内转运蛋白brnq。
3.根据权利要求2所述的异亮氨酸高产菌株，其特征在于：过表达基因均由ptuf启动子启动，其中基因支链氨基酸转氨酶ilve、乙酰乳酸合酶ilvbnp176s-d426e、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v拷贝数之比为2︰3︰2，即支链氨基酸转氨酶ilve基因为2拷贝、乙酰乳酸合酶ilvbnp176s-d426e基因为3拷贝、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v基因为2拷贝，其他过表达基因均为单拷贝。
4.根据权利要求2所述的异亮氨酸高产菌株，其特征在于：所述丙酮酸羧化酶pyc、天冬氨酸激酶lysca279t、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、高丝氨酸脱氢酶hom、高丝氨酸激酶thrb、苏氨酸合酶thrc、苏氨酸脱水酶ilvav140m-f383v、乙酰乳酸合酶ilvbnp176s-d426e、酮醇酸还原异构酶ilvc、支链氨基酸转氨酶ilve、亮氨酸响应调控因子lrp、支链氨基酸外排蛋白brnfe和支链氨基酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴开水，郭文斌，校军锋，曹阳，耿彪，
申请(专利权)人：江苏元易邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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