【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种西瓜花叶病毒wmv及侵染性克隆载体、构建方法和应用。
技术介绍
1、自然界中病毒种类纷繁复杂，关于植物病毒最早的记载可以追溯到1597年。根据ictv最新病毒分类报告，目前已知植物病毒大概有2100多种，可以对农作物、观赏作物、经济作物等造成严重经济损失，且导致的病害早期不易发现，并且防治困难，也因此被称为植物“癌症”。
2、西瓜花叶病毒是马铃薯y病毒属病科、马铃薯y病毒属病毒，在世界各地均有分布。于1954年首次在弗罗里达的西瓜上发现，自然条件下可侵染葫芦科(黄瓜、西瓜、西葫芦等)、藜科、豆科(刺槐)等多种作物。病毒的侵染性克隆对于解析病毒的与寄主植物之间的相互作用机制、明确病毒蛋白的功能、田间分子检测wmv的发生情况、基因表达或沉默载体的遗传工程构建、抗wmv药剂筛选和药效检测等方面的工作具有重要意义。
3、目前在研究与生产缺少可用的西瓜花叶病毒的侵染性克隆，因此无法有效的对抗wmv的西瓜种质资源进行筛选。此外，由于病毒侵染性克隆可用于植物不通过传统转基因的方法进行基因编辑，加速基因功能研究与抗病育种工作。然而，目前缺少可用的西瓜花叶病毒wmv的侵染性克隆载体，严重阻碍了相关科学研究与农业生产的发展。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种西瓜花叶病毒wmv及侵染性克隆载体、构建方法和应用。
2、专利技术人研究团队在黄瓜叶片中发现了一种马铃薯y病毒属(potyvirus)新病毒——西瓜花叶病毒w
3、针对该西瓜花叶病毒wmv，本专利技术提供了西瓜花叶病毒wmv的侵染性克隆载体，具体为：将西瓜花叶病毒wmv全基因组序列构建到pcb301载体而得，命名为pcb301-wmv载体；所述pcb301载体中含有35s启动子和核酸酶rz。
4、其中，所述pcb301-wmv载体的基因序列如seq id no：2所示。
5、本专利技术所述西瓜花叶病毒wmv的侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：
6、(1)根据西瓜花叶病毒wmv全基因序列设计三对特异性引物：pcb301-stu1-f、wmv-a2-r、wmv-b2-f、wmv-b2-r、wmv-c2-f、pcb301-sma1-r，引物序列如seq id no：3-8所示；所述西瓜花叶病毒wmv全基因组序列如seq id no：1所示；
7、(2)分别以引物对pcb301-stu1-f/wmv-a2-r、wmv-b2-f/r、wmv-c2-f/pcb301-sma1-r，分三段扩增wmv核苷酸全序列，分别得到三段特异的pcr条带，并回收特异的pcr条带，命名为wmv-a2、wmv-b2、wmv-c2；
8、(3)构建pcb301-wmv重组载体质粒：使用stu1和sma1双酶切pcb301-rz载体质粒，并切胶回收纯化，将三个目的pcr片段与经双酶切的pcb301载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌dh5α，通过菌落pcr筛选阳性克隆并扩繁培养，提取质粒，通过酶切验证、测序验证正确后，从而获得pcb301-wmv重组载体质粒。
9、其中，所述步骤(1)具体为，将wmv全基因组序列均分为三段，分别设计三对特异性引物：pcb301-stu1-f、wmv-a2-r、wmv-b2-f、wmv-b2-r、wmv-c2-f、pcb301-sma1-r，每一段的下游引物和下一段的上游引物有20bp的重叠，便于后续的片段重组。
10、其中，所述步骤(2)具体为，分别以引物对pcb301-stu1-f/wmv-a2-r、wmv-b2-f/r、wmv-c2-f/pcb301-sma1-r扩增wmv核苷酸全序列，分别得到三段特异的pcr条带，经过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化特异的pcr目的条带。
11、其中，所述步骤(3)具体为，通过两个限制性内切酶stu1和smal酶切pcb301-rz载体质粒，经过琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收纯化，将三个目的pcr片段wmv-a2、wmv-b2、wmv-c2等比例混合与经stu1和sma1双酶切的pcb301载体通过in-fusion进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌dh5α，通过菌落pcr筛选阳性克隆并扩繁培养，提取质粒，通过stu1和smal双酶切验证、测序验证正确后，转化到农杆菌gv3101中。
12、本专利技术的西瓜花叶病毒wmv或pcb301-wmv侵染性克隆载体或含有pcb301-wmv载体质粒的农杆菌菌株可用于研究wmv鉴定检测、基因表达或沉默、wmv的抗性种质资源分析、抗wmv药剂药效检测、wmv编码蛋白的功能、wmv病毒与寄主因子之间的相互作用、理解wmv的致病机制并挖掘寄主植物针对wmv侵染的抗性因子或感病因子，为wmv病毒病害的防治提供新策略。
13、同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
14、(1)本专利技术在黄瓜叶片中发现了一种马铃薯y病毒属(potyvirus)病毒，小rna测序鉴定以及pcr扩增测序通过snapgene拼接获得了病毒的全核苷酸序列，并构建了具有侵染活性的wmv的侵染性克隆，将其接种于健康西瓜、黄瓜、甜瓜与西葫芦植物(葫芦科作物)，能稳定的侵染，并且从接种的黄瓜植物上检测到了wmv的存在。
15、(2)本专利技术通过多片段重组的方法将wmv病毒的基因组构建到高效植物表达载体pcb301上，并获得了具有系统侵染能力的病毒载体。
16、(3)本专利技术提供的wmv农杆菌菌株使得wmv长期大量保存。
17、(4)本专利技术wmv病毒的侵染性克隆方便了后续的wmv与寄主植物之间的相互作用、wmv蛋白功能、wmv分子检测、抗wmv药剂药效检测等研究。
18、(5)本专利技术wmv的侵染性克隆的构建成功为全面了解该病毒编码蛋白的特性、遗传变异、发生规律以及致病机制，为wmv病害的防控策略提供便利条件，对提高葫芦科植物黄瓜的产量与品质具有重要的意义。
19、下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的西瓜花叶病毒wmv及侵染性克隆载体、构建方法和应用作进一步说明。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种西瓜花叶病毒WMV，其特征在于：其全基因组序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述西瓜花叶病毒WMV的侵染性克隆载体，其特征在于：将西瓜花叶病毒WMV全基因组序列构建到pCB301载体而得，命名为pCB301-WMV载体；所述pCB301载体中含有35S启动子和核酸酶Rz。
3.根据权利要求2所述的西瓜花叶病毒WMV的侵染性克隆载体，其特征在于：所述pCB301-WMV载体的基因序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求2或3所述西瓜花叶病毒WMV的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种含有权利要求2或3所述的西瓜花叶病毒WMV的侵染性克隆载体的农杆菌菌株。
6.权利要求1所述的西瓜花叶病毒WMV或权利要求2或3所述的侵染性克隆载体或权利要求5所述的农杆菌菌株在研究西瓜花叶病毒WMV与寄主植物之间的相互作用、西瓜花叶病毒WMV基因功能、西瓜花叶病毒WMV分子检测以及抗西瓜花叶病毒WMV的植物种质资源与抗性药筛选中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种西瓜花叶病毒wmv，其特征在于：其全基因组序列如seq id no：1所示。
2.权利要求1所述西瓜花叶病毒wmv的侵染性克隆载体，其特征在于：将西瓜花叶病毒wmv全基因组序列构建到pcb301载体而得，命名为pcb301-wmv载体；所述pcb301载体中含有35s启动子和核酸酶rz。
3.根据权利要求2所述的西瓜花叶病毒wmv的侵染性克隆载体，其特征在于：所述pcb301-wmv载体的基因序列如seq id no：2所示。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：李方方，葛林豪，潘萌娇，周雪平，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。