【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及dehp毒性检测，具体涉及一种利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法。
技术介绍
1、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(dehp)是一种广泛用于聚氯乙烯产品的增塑剂，是内分泌干扰物之一。其通过饮食、皮肤和呼吸接触在体内蓄积，影响肝脏、肾脏、睾丸和卵巢等等器官功能障碍，dehp的健康风险主要与生殖发育毒性、遗传毒性、内分泌干扰毒性和免疫系统毒性有关。由于dehp在人体内两小时即可代谢为mehp等代谢物，因此体外细胞实验多用mehp代替dehp进行染毒。dehp可以显著降低骨髓造血干细胞的增值数量。并且骨髓是重要的造血器官和免疫器官，各种血细胞均由骨髓多能造血干细胞分化而来。在机体处于损伤、感染以及自身免疫激活状态时，成熟的血细胞既是炎性因子的主要来源，也是炎症反应所必须的下游响应因素，而骨髓造血干细胞是炎症反应中重要的一环。研究dehp对于造血干细胞的影响确有必要。目前，还没有一种简单高效的体外研究方法确定不同浓度dehp对于造血干细胞分化毒作用。
2、公布号为cn102095716a的中国专利申请文献公开了一种激光拉曼光谱检测dehp的方法，包括如下步骤：用拉曼光谱仪检测样品中的邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(dehp)：设置激光功率：20-300mw，扫描时间2-20s，对邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(dehp)甲醇液进行激光扫描检测。将建立的方法应用于实际体系中dehp的测定，具有很好的检测效果。用gaussian w03理论计算对激光拉曼谱图中的各个特征峰进行详细指认。该方法提供了一种检测速度快
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于如何提出一种检测不同浓度dehp对于造血干细胞分化毒性作用的方法。
2、本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
3、本专利技术提出一种利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法，包括以下步骤：
4、(1)间充质干细胞的培养：先稳定小鼠间充质干细胞(f1代)的细胞状态，再进行传代培养，培养至f3代的对数生长期；
5、(2)造血干细胞的培养：将小鼠骨髓造血干细胞(f1代)预处理后，用间充质干细胞培养基重悬，吹打混匀；
6、(3)造血干细胞分化实验并检测dehp：包括以下步骤：
7、s1：将步骤(1)获得的间充质干细胞种板，培养至孔板中间充质干细胞长至汇合状态，期间隔一天换液一次；
8、s2：将步骤(2)的造血干细胞种植到步骤s1的孔板中；
9、s3：向间充质干培养基中给药mehp，并补充促造血干细胞分化细胞因子，培养至鹅卵石状区域明显可见；
10、(说明：由于dehp在人体内两小时即可代谢为mehp等代谢物，因此体外细胞实验多用mehp代替dehp进行染毒)
11、s4：收集细胞，上流式细胞仪分析测定。
12、有益效果：本专利技术采用小鼠骨髓造血干细胞与间充质干细胞联合培养，利用流式细胞术确定dehp对造血干细胞分化状态的毒性作用。本方法方便快捷，14天即可得出结果。
13、优选的，所述步骤(1)中稳定小鼠间充质干细胞(f1代)的细胞状态具体为：先用酒精喷洒细胞培养瓶身消毒，然后取下封口膜，轻旋一点瓶口，置于细胞培养箱中静置3-4h。
14、优选的，所述步骤(1)的传代培养具体包括：将小鼠间充质干细胞(f1代)清洗，加入胰蛋白酶消化液，孵育至细胞回缩变圆，吹打混匀，静置培养。
15、优选的，所述步骤(1)中培养的条件为37℃、5％co2。
16、优选的，所述步骤(2)的预处理具体包括：将装有小鼠骨髓造血干细胞(f1代)的培养瓶身消毒，取出培养基，离心，去上清液，收集细胞沉淀。
17、优选的，所述步骤s1中间充质干细胞种板具体包括：将计算好的细胞悬液与培养基充分混匀后，加入到孔板中，均匀铺板，摇晃，静置。
18、优选的，所述孔板中每孔加入5×104/ml的间充质干细胞。
19、优选的，所述步骤s3中促造血干细胞分化细胞因子包括干细胞生长因子(scf)、促血小板生成素(tpo)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)中的一种或多种。
20、优选的，所述步骤s4中收集细胞具体包括：吸出孔板内的培养基，清洗，加入胰蛋白酶消化液，孵育至细胞细胞变圆收缩，离心，去上清，重悬，过筛。
21、优选的，所述胰蛋白酶消化液的浓度为0.25％。
22、本专利技术的优点在于：
23、1、本专利技术采用小鼠骨髓造血干细胞与间充质干细胞联合培养，利用流式细胞术确定dehp对造血干细胞分化状态的毒性作用。本方法方便快捷，14天即可得出结果。
24、2、本专利技术方法方便快捷，能在较短的时间内判断不同浓度的dehp对于骨髓造血干细胞的毒性作用，只需要普通的仪器设备即可完成。本专利技术对于选择合适浓度的dehp作为增塑剂具有较高的参考价值，适于推广应用。
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1.一种利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)中稳定小鼠间充质干细胞(F1代)的细胞状态具体为：先用酒精喷洒细胞培养瓶身消毒，然后取下封口膜，轻旋一点瓶口，置于细胞培养箱中静置3-4h。
3.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)的传代培养具体包括：将小鼠间充质干细胞(F1代)清洗，加入胰蛋白酶消化液，孵育至细胞回缩变圆，吹打混匀，静置培养。
4.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的条件为37℃、5％CO2。
5.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(2)的预处理具体包括：将装有小鼠骨髓造血干细胞(F1代)的培养瓶身消毒，取出培养基，离心，去上清液，收集细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用
7.根据权利要求6所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述孔板中每孔加入5×104/ml的间充质干细胞。
8.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤S3中促造血干细胞分化细胞因子包括干细胞生长因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤S4中收集细胞具体包括：吸出孔板内的培养基，清洗，加入胰蛋白酶消化液，孵育至细胞细胞变圆收缩，离心，去上清，重悬，过筛。
10.根据权利要求9所述的利用造血干细胞模型检测DEHP毒性作用的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶消化液的浓度为0.25％。
...【技术特征摘要】
1.一种利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)中稳定小鼠间充质干细胞(f1代)的细胞状态具体为：先用酒精喷洒细胞培养瓶身消毒，然后取下封口膜，轻旋一点瓶口，置于细胞培养箱中静置3-4h。
3.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)的传代培养具体包括：将小鼠间充质干细胞(f1代)清洗，加入胰蛋白酶消化液，孵育至细胞回缩变圆，吹打混匀，静置培养。
4.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的条件为37℃、5％co2。
5.根据权利要求1所述的利用造血干细胞模型检测dehp毒性作用的方法，其特征在于，所述步骤(2)的预处理具体包括：将装有小鼠骨髓造血干细胞(f1代)的培养瓶身消毒，取出培养基，离心，去上清液，收集细胞沉淀。
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵玲俐，宁夏，蔡晓玥，胡蝶，李琦梦，郑远卓，李晓璐，蔡杨，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：
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