【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学和生物，尤其涉及ipc g01n33，更具体地涉及，一种幽门螺旋杆菌lf-era检测引物和探针及检测试剂盒。
技术介绍
1、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，h.pylori)是一种寄生在胃部和十二指肠的革兰氏阴性微量需氧细菌，是危害人类健康最常见的病原体之一。1994年，世界卫生组织将hp定义为ⅰ类致癌因子。2021年，美国公共卫生机构将hp列为新增的致癌物。此外，hp感染还与慢性胃炎、消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病的发生密切相关。当前，hp感染仍然是全世界一个重大的公共卫生问题，全球自然人群感染率超过50％，我国人群的hp感染率约为35％～55％。
2、幽门螺旋杆菌感染的诊断方法依据取材有无创伤性分为两大类：侵入性检测方法和非侵入性检测方法。侵入性检测方法依赖于胃镜取材，包括组织学检测、细菌培养、快速尿素酶试验(rut)以及幽门螺旋杆菌核酸检测；非侵入性检测方法则包括血清学(抗体)检测、粪便幽门螺旋杆菌抗原检测或基因检测以及尿素呼气试验(ubt)等。不同诊断方法各有其优势和局限性，其中最常用的分型检测方法为血清学(抗体)检测和基因检测。但是，普通的hp基因检测要求价格昂贵的精密仪器和专业技术人员操作，不适用于偏远地区及普通家庭自测的推广应用。
3、在自然环境中，人类感染幽门螺旋杆菌的途径推测为经口感染后定植于胃部诱发一系列消化道疾病。口腔的检测可以发现胃部感染前的细菌感染，并揭示胃部感染久治不愈的原因。由于幽门螺旋杆菌在口腔中处于非活跃代谢状态且一般来说
4、现有专利cn201510748326.7公开了一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重pcr检测方法；该专利试剂盒基于采用多重pcr同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测。但该试剂盒需要特定的pcr仪器和相应的设备，鉴定方法复杂，检测时间长，检测成本高。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的问题，本专利技术第一方面提供了一种幽门螺旋杆菌lf-era检测引物和探针，为hp特异性引物和探针，所述hp特异性引物包括上游引物1f、2f、3f中的一种或多种，和下游引物1r、2r、3r中的一种或多种。
2、优选的，所述上游引物1f的碱基序列为：
3、seq id no：1：5’-actaatttgaataatctcgctatcactagtct-3’、
4、上游引物2f的碱基序列为：
5、seq id no：2：5’-gtcttataaggcgggatttagaagataaacta-3’、
6、上游引物3f的碱基序列为：
7、seq id no：3：5’-gatttagaagataaactagccactaaaggatt-3’、
8、下游引物1r的碱基序列为：
9、seq id no：4：5’-tttccttagggatttttcaagatctttctgag-3’、
10、下游引物2r的碱基序列为：
11、seq id no：5：5’-tagggatttttcaagatctttctgagcttttt-3’；
12、下游引物3r的碱基序列为：
13、seq id no：6：5’-cgtttccttagggatttttcaagatctttct-3’、
14、探针的碱基序列为：
15、seq id no：7：5’-gatttagaagataaactagccactaaaggatttccctacaagaagc-3’。
16、优选的，所述下游引物1r、2r和3r的碱基序列5’端连接biotin(生物素)。
17、优选的，所述探针的碱基序列的5’端连接dig(地高辛)，3’端连接c3 spacer，并对第32位碱基进行四氢呋喃脱碱基位点(thf)修饰；
18、优选的，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为0.01μm-10μm；进一步优选的，为0.1μm-10μm；进一步优选的，为5μm。
19、优选的，所述上游引物、下游引物和探针由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。
20、本专利技术中，通过设计特异性上游引物、下游引物和探针，提高了试剂盒的特异性与准确性。本专利技术人创造性地根据幽门螺旋杆菌的细胞毒素相关基因a(caga)序列保守区设计并分别优化设计了3条上游引物、3条下游引物和1条探针，确保等温扩增反应的特异性，通过进一步筛选，得到了能够特异性扩增hp dna和hp菌，不扩增变异链球菌、具核梭杆菌聚核亚种、内氏放线菌、嗜酸乳杆菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、唾液链球菌等口腔细菌的引物和探针组合，从而提高了试剂盒的特异性与准确性。
21、本专利技术中，通过特定的引物浓度，提高了试剂盒的特异性和准确性，同时减少了假阳性的出现。本专利技术人发现，上游、下游引物的浓度均影响着lf-era检测方法的准确度和特异性。当浓度低于0.1μm时，无法获得可检出水平的阳性产物，当浓度过高时，容易产生假阳性，为了获得扩增效率高且不出现假阳性的结果，选择了特定的引物浓度。
22、本专利技术第二方面提供了一种幽门螺旋杆菌的lf-era试剂盒，试剂盒是基于era等温扩增并结合免疫层析技术，以纳米碳标记夹心法检测，产品操作简单30min即可看到结果，适用于普通人群及胃部幽门螺旋杆菌感染康复者的口腔样本的检测。
23、优选的，所述幽门螺旋杆菌的lf-era试剂盒，包括hp特异性引物和探针、era基础扩增体系、样本稀释液和检测试剂卡；
24、优选的，所述检测试剂卡包括样品垫、nc膜、碳垫、吸水纸和pvc底板。
25、优选的，所述era基础扩增体系包括溶解剂、基础扩增剂、dd h2o和激活剂。
26、优选的，所述era基础扩增体系购自苏州先达基因科技有限公司。
27、优选的，所述样本稀释液为8.1mm na2hpo4、1.9mm nah2po4和0.85％(w/v)nacl，ph7.4。
28、优选的，所述样品垫需要用样品垫处理液处理，烘干过夜。
29、优选的，所述样品垫处理液包括nah2po4、na2hpo4、nacl、蛋白稳定剂
30、2#、tween-20和proclin300；
31、优选的，所述样品垫处理液的制备方式为：称取nah2po4、na2hpo4、nacl、蛋白稳定剂2#、tween-20、proclin300，加入纯水，配制成0.15％(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种幽门螺旋杆菌LF-ERA检测引物和探针，其特征在于，为Hp特异性引物和探针，所述Hp特异性引物包括上游引物1F、2F、3F中的一种或多种和下游引物1R、2R、3R中的一种或多种；
2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌LF-ERA检测引物和探针，其特征在于，所述下游引物1R、2R、3R的碱基序列5’端连接Biotin；
3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌LF-ERA检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为0.01μM-10μM。
4.根据权利要求3所述的幽门螺旋杆菌LF-ERA检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为0.1μM-10μM。
5.一种包含权利要求1-4任一项所述的LF-ERA引物和探针的幽门螺旋杆菌的LF-ERA试剂盒，其特征在于，包括Hp特异性引物和探针、ERA基础扩增体系、样本稀释液和检测试剂卡。
6.根据权利要求5所述的幽门螺旋杆菌的LF-ERA试剂盒，其特征在于，所述ERA基础扩增体系包括溶解剂、基础扩增剂、dd H2O和激活剂。
8.根据权利要求5所述的幽门螺旋杆菌的LF-ERA试剂盒，其特征在于，所述检测试剂卡包括样品垫、NC膜、碳垫、吸水纸和PVC底板。
9.根据权利要求8所述的幽门螺旋杆菌的LF-ERA试剂盒，其特征在于，所述样品垫需要用样品垫处理液处理，烘干过夜；所述样品垫处理液包括NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、蛋白稳定剂2#、Tween-20和ProClin300；所述碳垫包括纳米碳标记Dig抗体的碳垫和纳米碳标记鼠IgG的碳垫；所述NC膜为包被有相互平行的检测线T线和质控线C线，间隔距离为5～10mm，包被好后烘干过夜。
10.根据权利要求9所述的幽门螺旋杆菌的LF-ERA试剂盒，其特征在于，所述纳米碳标记Dig抗体的碳垫的制备方法为：用纳米碳标记的Dig抗体，用40～50％纳米碳标稀释液稀释10～15倍后进行铺垫，烘干过夜；所述纳米碳标记鼠IgG的碳垫的制备方法为：用纳米碳标记的鼠IgG，用40～50％纳米碳标稀释液稀释10～15倍后进行铺垫，烘干过夜。
...【技术特征摘要】
1.一种幽门螺旋杆菌lf-era检测引物和探针，其特征在于，为hp特异性引物和探针，所述hp特异性引物包括上游引物1f、2f、3f中的一种或多种和下游引物1r、2r、3r中的一种或多种；
2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌lf-era检测引物和探针，其特征在于，所述下游引物1r、2r、3r的碱基序列5’端连接biotin；
3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌lf-era检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为0.01μm-10μm。
4.根据权利要求3所述的幽门螺旋杆菌lf-era检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为0.1μm-10μm。
5.一种包含权利要求1-4任一项所述的lf-era引物和探针的幽门螺旋杆菌的lf-era试剂盒，其特征在于，包括hp特异性引物和探针、era基础扩增体系、样本稀释液和检测试剂卡。
6.根据权利要求5所述的幽门螺旋杆菌的lf-era试剂盒，其特征在于，所述era基础扩增体系包括溶解剂、基础扩增剂、dd h2o和激活剂。
7.根据权利要求5所...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡小龙，和灼淇，屈武斐，
申请(专利权)人：上海八通生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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