【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有3-差向异构酶活性的分离的多肽、编码该多肽的多核苷酸及其使用方法。
技术介绍
1、常规糖诸如蔗糖的过量摄入可以对人类健康产生影响。需要替代品来降低糖摄入量。自然界中存在量有限的诸如单糖等稀有糖可作为这种替代品。稀有糖是食品和药品中有用的添加剂和化合物，并且稀有糖的有益代谢健康效应已在人体试验、动物实验和体外实验中显示出来。稀有糖的化学合成存在几个缺点，包括反应条件过激、产生过量化学废物、形成不需要的副产物和难以纯化的过程。相比之下，通过酶途径生物合成稀有糖更环境友好，具有温和的反应条件和高特异性。催化酮糖和酮糖衍生物差向异构化的酶在稀有糖的生物合成中起着重要作用。在稀有糖中，d-阿洛酮糖(d-psicose)(d-核糖-2-己酮糖(d-ribo-2-hexulose)或d-阿洛酮糖(d-allulose))是作为蔗糖的更健康替代品研究最深入的一种糖，其具有70％的相对甜度，但只有蔗糖的能量的0.3％和高溶解度。这种糖最近获得了美国食品和药物管理局(fda)公认的安全(gras)状态，并且申请欧盟批准作为食品成分正在研究中。
2、来自d-塔格糖-差向异构酶(dte)和d-阿洛酮糖3-差向异构酶(dpe，也称为d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-allulose 3-epimerase)(dae))家族的酶催化d-果糖在c3位置向d-阿洛酮糖的可逆转化。此外，还已知l-核酮糖3-差向异构酶(lre)可将d-果糖转化为d-阿洛酮糖。这些已知的3-差向异构酶的最佳催化效率需要理想的ph和温度范围(ph在7.0至
3、嗜酸菌是种类繁多的生态和经济上重要的生物，其在酸性自然环境和人工环境中茁壮成长。它们具有调节细胞内的ph值的细胞适应网络。嗜酸菌的几种胞外酶在比细胞质ph低得多的ph下起作用。在低ph下稳定的诸如淀粉酶、蛋白酶、连接酶、纤维素酶、木聚糖酶、α-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶和酯酶等酶已知来自各种嗜酸微生物。然而，能够在低ph条件下催化反应的酶是稀有的。需要寻找新的酸稳定酶来源。一个这种来源可以在当今现存的嗜酸菌酶的祖先中发现。
4、天然存在的酶表现出高催化活性速率，是负责保护手性的对映异构纯催化剂，在酶催化中提供对映选择性，并且由于其可生物降解性，具有很小的环境影响。尽管有这些优点，但用于催化反应的酶的可用性是有限的，因为在自然界中并不总是能找到具有所需性质的酶。
5、祖先序列重建(asr)使用同源氨基酸序列输入来推断祖先氨基酸序列。asr为可能会影响活性和稳定性的远离活性位点的氨基酸替换提供了一种信息工具。使用这种方法进行酶设计包括基于公共数据库中可用的同源氨基酸序列的比较来推断祖先序列，人工合成编码推断的氨基酸序列的基因，以及在合适的宿主生物中表达该基因。结合经验分析，这种方法用于定义祖先蛋白质的各种物理性质，包括热稳定性和底物特异性，并鉴定关键氨基酸残基。祖先设计创造了具有自然界中未发现的期望特性的酶，并且可以通过将推定的祖先氨基酸替换到天然酶中来改善天然酶，而不会损害催化活性。这导致了asr应用于在工业过程中可能有用的蛋白质和酶的工程化中。
6、仍然非常需要具有3-差向异构酶活性的新型多肽，其能够在低ph条件下将d-果糖转化为d-阿洛酮糖。
技术实现思路
1、在一个方面，提供了一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
2、(i)seq id no.：1-12和14-16，或与其具有至少88％序列同源性的功能类似物；和
3、(ii)seq id no.13，或与其具有至少92％序列同源性的功能类似物。
4、在一个实施方式中，多肽的特征在于具有3-差向异构酶活性。
5、在一个实施方式中，3-差向异构酶活性包括d-阿洛酮糖3-差向异构酶活性。
6、在一个实施方式中，肽是分离的多肽或合成的多肽。
7、在另一个方面，提供了一种编码本专利技术多肽的多核苷酸。
8、在一个实施方式中，多核苷酸包含选自seq id no.：17-32的核酸序列。
9、在一个实施方式中，多核苷酸是分离的多核苷酸或人工多核苷酸。
10、在另一个方面，提供了一种质粒或表达载体，其包含本专利技术的多核苷酸。
11、在另一个方面，提供了一种转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其包含：本专利技术的多肽；本专利技术的多核苷酸；本专利技术的质粒或表达载体；或(a)至(c)的任意组合。
12、在一个实施方式中，转基因细胞或所述转染细胞选自地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌、粟酒裂殖酵母菌、恶臭假单胞菌、毕赤酵母菌、曲霉菌、里氏木霉菌、谷氨酸杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
13、在另一个方面，提供了源自本专利技术的转基因细胞或转染细胞的提取物，或其任意部分。
14、在一个实施方式中，提取物包含所述多核苷酸、所述多肽或两者。
15、在另一个方面，提供了一种转基因植物、转基因植物组织或植物部分，其包含：本专利技术的多肽；本专利技术的多核苷酸；本专利技术的质粒或表达载体；本专利技术的转基因细胞或转染细胞；或(a)至(d)的任意组合。
16、在另一个方面，提供了一种组合物，其包含：
17、a.本专利技术的多肽
18、b.本专利技术的多核苷酸
19、c.本专利技术的质粒或表达载体
20、d.本专利技术的转基因细胞或转染细胞
21、e.本专利技术的提取物
22、f.本专利技术的转基因植物组织或植物部分；或
23、g.(a)至(f)的任意组合，
24、以及可接受的载体。
25、在一个实施方式中，组合物进一步包含二价金属阳离子。
26、在一个实施方式中，二价阳离子选自：co2+、mg2+、mn2+、mo2+、ni2+及其任意组合。
27、在一个实施方式中，组合物进一步包含水性溶剂。
28、在一个实施方式中，多肽结合到固体载体上。
29、在一个实施方式中，结合是通过共价键或非共价相互作用。
30、在一个实施方式中，组合物进一步包含能够结合所述多肽和所述固体载体二者的化学试剂。
31、在一个实施方式中，组合物进一步包含果糖、d-阿洛酮糖或两者。
32、在另一个方面，提供了一种合成具有3-差向异构酶活性的多肽的方法，其包括以下步骤：提供包含质粒或表达载体的细胞，该质粒或表达载体包含与选自seq id no.：17-32的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；和培养来自步骤(a)的所述细胞，使得由所述质粒或表达载体编码的多肽被表达，从而合成多肽。
33、在一个实施方式中，方法进一步包括选自以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于具有3-差向异构酶活性。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述3-差向异构酶活性包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，并且其中所述多肽包含选自SEQ ID No.：4、9、10、11、12、13、14和16的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其为分离的多肽或合成多肽，并且其中所述多肽包含选自SEQ ID No.：11、12和13的氨基酸序列。
5.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其包含选自SEQ ID No.：17-32的核酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的多核苷酸，其为分离的多核苷酸或人工多核苷酸。
8.包含权利要求5至7中任一项所述的多核苷酸的质粒或表达载体。
9.一种转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其包含：
10.根据权利要求9所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其为单细胞生物、多细胞生物的细胞和培
11.根据权利要求10所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述单细胞生物包括真菌或细菌。
12.根据权利要求11所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述真菌为酵母细胞。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述转基因细胞或所述转染细胞选自地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌、粟酒裂殖酵母菌、恶臭假单胞菌、毕赤酵母菌、曲霉菌、里氏木霉菌、谷氨酸杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述多细胞生物的细胞包括植物细胞。
15.衍生自权利要求9至14中任一项所述的转基因细胞或转染细胞的提取物，或其任何部分。
16.根据权利要求15所述的提取物，其包含所述多核苷酸、所述多肽或两者。
17.一种转基因植物、转基因植物组织或植物部分，其包含：
18.一种组合物，其包含：
19.根据权利要求18所述的组合物，其进一步包含二价金属阳离子。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述二价阳离子选自：Co2+、Mg2+、Mn2+、Mo2+、Ni2+及其任意组合。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的组合物，其进一步包含水性溶剂。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述多肽结合至固体载体。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述结合是通过共价键或非共价相互作用。
24.根据权利要求22或23所述的组合物，其进一步包含能够结合所述多肽和所述固体载体的化学试剂。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的组合物，其进一步包含果糖、D-阿洛酮糖或两者。
26.一种合成具有3-差向异构酶活性的多肽的方法，其包括以下步骤：
27.根据权利要求26所述的方法，其进一步包括至少一个选自以下的步骤：回收所述多肽，至少部分纯化所述多肽，固定化所述多肽，及其任意组合。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述细胞为转基因细胞或用权利要求8所述的质粒或表达载体转染的细胞。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其进一步包括步骤(a)之前的步骤，其包括用所述质粒或表达载体导入或转染所述细胞。
31.一种生产D-阿洛酮糖的方法，其包括以下步骤：
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述条件包括：(i)温度在25℃至75℃之间；(ii)pH为在3至8.5之间，或(i)和(ii)两者。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述经受包括使所述反应混合物与二价金属阳离子接触。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述二价阳离子选自：Co2+、Mg2+、Mn2+、Mo2+、Ni2+及其任意组合。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述二价金属阳离子在所述反应混合物中以0.1mM至10mM范围内的浓度存在。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其进一步包括包含从所述反应混合物中分离所述D-阿洛酮糖的步骤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述分离包括：提取、沉淀、膜过滤或其任意组合...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于具有3-差向异构酶活性。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述3-差向异构酶活性包括d-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，并且其中所述多肽包含选自seq id no.：4、9、10、11、12、13、14和16的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其为分离的多肽或合成多肽，并且其中所述多肽包含选自seq id no.：11、12和13的氨基酸序列。
5.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其包含选自seq id no.：17-32的核酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的多核苷酸，其为分离的多核苷酸或人工多核苷酸。
8.包含权利要求5至7中任一项所述的多核苷酸的质粒或表达载体。
9.一种转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其包含：
10.根据权利要求9所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其为单细胞生物、多细胞生物的细胞和培养物中的细胞中的任意一种。
11.根据权利要求10所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述单细胞生物包括真菌或细菌。
12.根据权利要求11所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述真菌为酵母细胞。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述转基因细胞或所述转染细胞选自地衣芽孢杆菌、酿酒酵母菌、粟酒裂殖酵母菌、恶臭假单胞菌、毕赤酵母菌、曲霉菌、里氏木霉菌、谷氨酸杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的转基因细胞、转化细胞或转染细胞，其中所述多细胞生物的细胞包括植物细胞。
15.衍生自权利要求9至14中任一项所述的转基因细胞或转染细胞的提取物，或其任何部分。
16.根据权利要求15所述的提取物，其包含所述多核苷酸、所述多肽或两者。
17.一种转基因植物、转基因植物组织或植物部分，其包含：
18.一种组合物，其包含：
19.根据权利要求18所述的组合物，其进一步包含二价金属阳离子。
20.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：Z·Z·兹韦格哈弗特，D·S·塔菲克，
申请(专利权)人：安布罗西亚生物公司，
类型：发明
国别省市：
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