【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及临床医学领域，特别是涉及一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用。
技术介绍
1、自然杀伤细胞，又称nk细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，主要分布于外周血，淋巴结和骨髓中，是一类可直接杀伤病毒和肿瘤的免疫细胞。nk细胞的主要检测表型为cd3阴性、cd56和cd16阳性。
2、自然杀伤细胞外泌体（exosomes，exos）也称细胞外囊泡（extracellularvesicles，ev）,是源于细胞内，通过胞吐的作用分泌到细胞外，作用于靶细胞的一类含有核酸、蛋白质和小分子细胞毒蛋白、micrornas的小囊泡，其直径100~130nm，可以介导细胞间的信息交流。自然杀伤细胞的外泌体从细胞释放出来后通过胞吞或者胞膜融合的方式作用于受体细胞，转移各种dna、rna、蛋白质和脂质等生物活性分子，发挥信息传递和杀伤作用。目前没有相关来源于nk细胞的外泌体在杀伤人类乳头瘤病毒（hpv）的报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该自然杀伤细胞外泌体通过连续给药，可杀死hek293细胞中90%以上hpv病毒。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
4、分离获取外周血的单个核细胞，对所述单个核细胞进行扩增培养，得到高纯度的自然杀伤细胞；
5、利用超滤浓缩法提取所述自然杀
6、优选的是，所述扩增培养包括以下步骤：
7、用nk细胞激活培养基重悬所述单个核细胞，进行孵育培养；培养至第3天，补加nk细胞扩增培养基，之后每隔一天，补加一次所述nk细胞扩增培养基，培养至第14天，获取所述高纯度的自然杀伤细胞；
8、其中，所述nk细胞激活培养基为以无血清nk细胞培养基为基础，添加il-2、il-15、cd16抗体、cd137抗体、cd335抗体、沙培林和血浆；
9、所述nk细胞扩增培养基为以无血清nk细胞培养基为基础，添加il-2、il-15和血浆。
10、优选的是，所述nk细胞激活培养基为以无血清nk细胞培养基为基础，添加2000iu/ml il-2、100ng/ml il-15、100ng/ml cd16抗体、70ng/ml cd137抗体、50ng/ml cd335抗体、0.02ke/ml沙培林和5%血浆；
11、所述nk细胞扩增培养基为以无血清nk细胞培养基为基础，添加2000iu/ml il-2、100ng/ml il-15。
12、优选的是，所述超滤浓缩法提取自然杀伤细胞中的外泌体包括以下步骤：
13、经扩增培养得到的自然杀伤细胞液，离心后，取自然杀伤细胞的上清液；
14、将所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤，得到过滤液；
15、将所述过滤液采用分子截留量为500kd的中空纤维柱进行超滤浓缩，再用生理盐水进行置换，无菌过滤，得到自然杀伤细胞外泌体。
16、优选的是，所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤的条件为：流速2000ml/min，压力6-8psi。
17、优选的是，所述过滤液采用分子截留量为500kd的中空纤维柱进行超滤浓缩的条件为：500ml/min，压力6-8psi。
18、本专利技术还提供利用所述的制备方法制得的外泌体在如下任一项中的应用：
19、（1）在制备治疗人乳头瘤病毒感染的疾病的药物中的应用；
20、（2）在制备杀伤人乳头瘤病毒的药物中的应用。
21、本专利技术还提供一种治疗人乳头瘤病毒感染的疾病的药物，包括所述的制备方法制得的外泌体。
22、本专利技术还提供一种杀伤人乳头瘤病毒的药物，包括所述的制备方法制得的外泌体。
23、本专利技术公开了以下技术效果：
24、本专利技术从自然杀伤细胞中分离提取得到nk细胞外泌体，通过实验发现，将nk细胞外泌体和人乳头瘤病毒16型假病毒（hpv16pp）同时接种于hek293细胞，发现可降低20%的hpv16pp感染效率，证明nk细胞外泌体起到抗hpv病毒转染的作用；将hpv16pp接种于hek293细胞后检测阳性率，而后连续7天将nk细胞外泌体接入细胞中，发现杀死hek293细胞中90%以上hpv病毒，几乎检测不到感染病毒的阳性细胞，证明nk细胞外泌体起到杀伤hpv病毒的效果。本专利技术制备的nk细胞外泌体可以用于治疗hpv病毒感染的疾病药物的制备中，对治疗hpv提供了新的药物原料和治疗方向。
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1.一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15、100ng/mL CD16抗体、70ng/mLCD137抗体、50ng/mL CD335抗体、0.02KE/mL沙培林和5%血浆；
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩法提取自然杀伤细胞中的外泌体包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤的条件为：流速2000mL/min，压力6-8Psi。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述过滤液采用分子截留量为500KD的中空纤维柱进行超滤浓缩的条件为：流速500mL/min，压力6-8Psi。
6.利用权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的外泌体在如下任一项中的应用：
7.一种治疗人乳头瘤病毒感染的疾病的药物，其特征在于，包括权利要求1-5
8.一种杀伤人乳头瘤病毒的药物，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的外泌体。
...【技术特征摘要】
1.一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述nk细胞激活培养基为以无血清nk细胞培养基为基础，添加2000iu/ml il-2、100ng/ml il-15、100ng/ml cd16抗体、70ng/mlcd137抗体、50ng/ml cd335抗体、0.02ke/ml沙培林和5%血浆；
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩法提取自然杀伤细胞中的外泌体包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述上清液利用膜孔径为0.65...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘红，侯国栋，
申请(专利权)人：赛奥斯博生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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