【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞，具体是一种γδt细胞的制备方法。
技术介绍
1、近年来，癌症还一直是医学领域比较困扰的问题。γδt细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞。γδt细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过t细胞总数的5％。γδt细胞具有特异性识别抗原而无mhc限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。
2、目前，常规的γδt细胞培养方法对肿瘤细胞毒活性不高，方法步骤复杂、成本高昂、工序多、条件不可控，且对于设备环境的要求较高、不易于大批量规模化的生产，因此，我们提出了一种γδt细胞的制备方法来解决上述所提到的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种γδt细胞的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种γδt细胞的制备方法，包括以下步骤：
4、步骤一：提取外周血单个核细胞，采集样本后，制备分离，首先用pbs进行外周血等体积，脐血四倍体积稀释；
5、步骤二：将稀释后的血，50ml的量加到装有12ml分离液的50ml离心管中，400g离心30-40min，收集白膜层单个核细胞到新的50ml离心管当中，加入pbs定容到50ml，450g离心10min；
6、步骤三：去除上清，重悬细胞沉淀用50ml完全培养基，然后400g，离心10min，去上清，细胞继续用完全培养基重悬；
7、步骤
8、步骤五：提取肿瘤细胞来源的自噬小体，将自噬小体与γδt细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδt细胞。
9、作为本专利技术进一步的方案：所述γδtcocktails的浓度为1μl/ml。
10、作为本专利技术进一步的方案：所述步骤一提取外周血单个核细胞中，包括：采集人的外周静脉血；将外周静脉血进行分离得到全血细胞；对全血细胞分离得到单个核细胞。
11、作为本专利技术进一步的方案：所述步骤五中预设时间为45小时。
12、作为本专利技术进一步的方案：所述步骤五提取肿瘤细胞来源的自噬小体中，所述自噬小体通过在肿瘤细胞中加入自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂和溶酶体趋化剂后反应得到。
13、作为本专利技术进一步的方案：所述唑来膦酸zol因子中zol的浓度为1μg/ml。
14、作为本专利技术进一步的方案：所述步骤三中培养的条件是常规培养。
15、作为本专利技术进一步的方案：所述常规培养的条件为：培养温度为37℃，5％co2，相对湿度100％。
16、作为本专利技术进一步的方案：所述步骤四中白介素il-2浓度为100u/ml。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
18、该γδt细胞的制备方法，包括如下步骤：步骤一：提取外周血单个核细胞，采集样本后，制备分离，首先用pbs进行外周血等体积，脐血四倍体积稀释；步骤二：将稀释后的血，50ml的量加到装有12ml分离液的50ml离心管中，400g离心30-40min，收集白膜层单个核细胞到新的50ml离心管当中，加入pbs定容到50ml，450g离心10min；步骤三：去除上清，重悬细胞沉淀用50ml完全培养基，然后400g，离心10min，去上清，细胞继续用完全培养基重悬；步骤四：将步骤三中得到的细胞在完全培养基培养时，培养基为含10％血清的完全1640培养基，在培养基中加入唑来膦酸zol，浓度为50μm；以及加入白介素il-2与γδtcocktails，之后每次换液，再使用含10％血清的完全1640培养基重悬细胞，换液后加入同浓度的白介素il-2与γδtcocktails，获得γδt细胞；步骤五：提取肿瘤细胞来源的自噬小体，将自噬小体与γδt细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδt细胞；通过自噬小体和和γδt细胞进行共培养，从而制备得到特异性γδt细胞，与常规方法扩增的γδt细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδt细胞，且本专利技术所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来巨大的便利。
19、该γδt细胞的制备方法，达到了快速高效的效果，因为γδt细胞是无mhc限制性的免疫细胞，在体内有较快的免疫反应和较强的免疫作用，但是因为体内天然存在的很少，使得这部分细胞的作用一直为人们所忽视，为了使γδt细胞起到强烈的免疫作用，所以需要进行扩增，本方法较于传统磷酸盐刺激的方法，在培养14天后，经过实验验证，本方法培养γδt细胞占比均可达70％，而传统磷酸盐刺激方法仅为30％多；说明本方法可以起到显著的增高培养后γδt细胞的作用。
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1.一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述γδTCocktails的浓度为1μL/ml。
3.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤一提取外周血单个核细胞中，包括：采集人的外周静脉血；将外周静脉血进行分离得到全血细胞；对全血细胞分离得到单个核细胞。
4.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤五中预设时间为45小时。
5.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤五提取肿瘤细胞来源的自噬小体中，所述自噬小体通过在肿瘤细胞中加入自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂和溶酶体趋化剂后反应得到。
6.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述唑来膦酸ZOL因子中ZOL的浓度为1μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤三中培养的条件是常规培养。
8.根据权利要求7所述的一种γδT细胞的制备方法，其
9.根据权利要求1所述的一种γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤四中白介素IL-2浓度为100U/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种γδt细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种γδt细胞的制备方法，其特征在于，所述γδtcocktails的浓度为1μl/ml。
3.根据权利要求1所述的一种γδt细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤一提取外周血单个核细胞中，包括：采集人的外周静脉血；将外周静脉血进行分离得到全血细胞；对全血细胞分离得到单个核细胞。
4.根据权利要求1所述的一种γδt细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤五中预设时间为45小时。
5.根据权利要求1所述的一种γδt细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤五提取肿瘤细胞来源的自噬小...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈忠平，程远星，杨姗姗，余子文，陈则姜，邹环球，
申请(专利权)人：朗姿赛尔生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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