【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及thp-1诱导分化为巨噬细胞的方法及其在构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型中的应用。
技术介绍
1、巨噬细胞在体内具有吞噬肿瘤细胞的作用，吞噬后形成的杂合细胞在外周血中可以被检测到，目前被称为循环杂合细胞(circulating hybrid cells，chc)[1]。当前观点认为对这些细胞的进行富集和分析，可以获得关于肿瘤进展、肿瘤异质性和治疗反应的更多更全面的信息，所以很有必要建立体外细胞融合模型，并利用这一模型对chc的增殖、分化和功能开展研究。目前体外构建巨噬细胞和肿瘤细胞融合细胞的方法，通常是分离外周血来源的单核细胞，经体外诱导为巨噬细胞，然后再与肿瘤细胞共培养[2]。该技术的主要问题是每次实验都要抽取外周血，一方面操作上对技术要求高，另一方面还牵涉到伦理问题，同时外周血来源的单核细胞诱导为巨噬细胞的周期比较长，所获得巨噬细胞吞噬能力低，与肿瘤细胞共培养后杂合细胞比例低。
2、thp-1细胞系是一种人单核细胞白血病细胞系，于1980年由tsuchiya等人建立，在体外呈悬浮状态生长，而且可以长期传代。thp-1细胞系常用于感染或转染实验，且具有明显优势：相对于u937、hl-60、ml-2等白血病细胞系，thp-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征(包括细胞分化标记)；相对于人外周血单核细胞(pbmc)，thp-1更易在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，不存在pbmc的个体差异性问题，利于实验结果的重现。
3、thp-1也可以经诱导分化为巨噬细胞，但利用thp
技术实现思路
1、本专利技术针对上述问题进行，第一目的在于提供了thp-1诱导分化为高吞噬能力的巨噬细胞的方法，第二目的在于提供了该高吞噬能力的巨噬细胞在构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型中的应用及构建方法。
2、本专利技术的研究过程如下：在thp-1诱导分化为巨噬细胞的过程中先向培养基中添加佛波酯pma诱导thp-1分化为巨噬细胞，而后采用含吞噬活性促进剂的培养基换液处理巨噬细胞获得具备高吞噬能力的目标巨噬细胞。随后将该高吞噬能力的巨噬细胞与肿瘤细胞在低粘附孔板中共培养实现细胞融合，得到高比例的杂合细胞。
3、基于上述研究，本专利技术的具体技术方案如下：
4、本专利技术第一方面，提供了一种thp-1诱导分化为巨噬细胞的方法，包括如下步骤：
5、(1)将处于对数生长期的thp-1细胞离心，用含10％胎牛血清以及1％双抗的rpmi1640培养基重悬，并在培养基中加入诱导剂(终浓度为100ng/ml的佛波酯pma)；
6、(2)细胞经计数后，用含上述诱导剂的rpmi 1640培养基调整thp-1细胞密度为5×105个/ml，并将细胞种入六孔板，每孔加入细胞2ml，培养48h后，显微镜下观察thp-1细胞由悬浮细胞分化为贴壁细胞，说明巨噬细胞诱导成功；
7、(3)配置含吞噬活性促进剂的培养基，对细胞进行换液处理，24h后得到高吞噬活性的巨噬细胞。优选的，吞噬活性促进剂为终浓度为0.5μmol/l的贝沙罗汀。
8、本专利技术第二方面，提供了采用上述方法得到的巨噬细胞构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型的方法，构建步骤如下：将巨噬细胞和癌细胞均消化为单细胞后，以细胞数比为1:4的比例将巨噬细胞和癌细胞于低粘附u型底96孔板中进行悬浮共培养。
9、优选的，接种于96孔板的巨噬细胞数为25000个，所述癌细胞数为100000个。细胞密度较高、癌细胞数目相对多是为了保证巨噬细胞与癌细胞有比较多的接触机会。
10、优选的，进行共培养时，采用不含血清的巨噬细胞培养基进行培养，同时培养基内也不添加诱导剂和吞噬活性促进剂。
11、优选的，共培养时间控制在2小时内，便于观察到融合后双核细胞。
12、本专利技术的第三方面，提供了一种采用上述方法构建得到的巨噬-肿瘤杂合细胞模型。采用该模型可以获取肿瘤进展、肿瘤异质性和治疗反应的相关信息，并利用这一模型对循环杂合细胞(chc)的增殖、分化和功能开展研究。
13、显微镜下观察结果显示，明场环境下能够观察到融合细胞，平均直径为24μm；dapi染色后能够观察到融合细胞内的双细胞核；免疫荧光染色结果显示，融合细胞呈现巨噬细胞和肿瘤细胞两种颜色叠加后的颜色(比如红色和绿色叠加呈现黄色)，且细胞直径(24μm)明显大于单个未融合细胞(13～15μm)，同时可观察到明显双核细胞形态。
14、此外，统计对比发现，本专利技术方法的融合率可达5％～10％，较其他方法提高5倍左右。
15、本专利技术具体实施方式部分以人肺癌细胞系a549细胞为例，对于巨噬-肿瘤杂合细胞模型的构建效果进行展示，但本专利技术的方法不仅仅适合肺癌细胞系的巨噬-肿瘤杂合细胞构建，其他肿瘤细胞系也同样适用，如肝癌、胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肠胃类癌、前列腺癌、泌尿系统肿瘤等。
16、本专利技术的有益保障及效果：
17、本专利技术利用了体外培养细胞thp-1诱导成巨噬细胞的方法，获取具有高吞噬活性的巨噬细胞前后需要3天的时间，比起抽取外周血再进行单核细胞分离并诱导分化的方法，优点在于操作简单、快速、背景噪声低，同时避免伦理学限制。
18、本专利技术利用小分子化合物贝沙罗汀，大大提高了单核细胞经pma诱导获得的巨噬细胞的吞噬活性；
19、本专利技术利用低粘附板培养细胞，让巨噬细胞对癌细胞的吞噬过程在悬浮状态下进行，提高了融合效率，融合率可达5％～10％，较其他方法提高5倍左右。
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1.一种THP-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的THP-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的THP-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的THP-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于：
5.采用权利要求1～4任一项所述方法得到的巨噬细胞构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：将巨噬细胞和癌细胞均消化为单细胞后，以细胞数比为1:4的比例将巨噬细胞和癌细胞于低粘附U型底孔板中进行共培养。
6.根据权利要求5所述的构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型的方法，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型的方法，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型的方法，其特征在于：
9.一种巨噬-肿瘤杂合细胞模型，其特征在于，采用权利要求5～8任一项所述的方法构建得到。
【技术特征摘要】
1.一种thp-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的thp-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的thp-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的thp-1诱导分化为巨噬细胞的方法，其特征在于：
5.采用权利要求1～4任一项所述方法得到的巨噬细胞构建巨噬-肿瘤杂合细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：将巨噬...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱海英，张红霞，蔡润东，杨袁媛，郝家玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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