【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽制备，尤其涉及一种短肽的制备方法。
技术介绍
1、短肽是一种由少数氨基酸组成的蛋白质片段，也被称为短链肽或低聚肽。肽是介于氨基酸和蛋白质之间的物质，具有精准的蛋白质片段的特点。短肽的分子量小，易被人体吸收，且具有多种生物活性，因此在生物化学与分子生物学领域具有广泛的研究价值。
2、短肽可以作为局部药物应用于伤口愈合、抗菌和抗炎等领域。在化妆品中，短肽可被用于光促进胶原蛋白合成、提高皮肤弹性和保湿等方面，有助于改善皮肤质量和延缓皮肤衰老。在食品中，短肽可以作为调味剂和添加剂用于食品和饮料中。随着研究的深入，短肽的应用价值在医疗、食品和化妆品等领域得到广泛的应用。
3、总之，对短肽的研究背景主要是基于其在生物化学与分子生物学中的重要性和应用价值。通过深入研究和开发短肽的应用，可以更好地发挥其生理功能和生物活性，为人类健康和生活质量的提高做出贡献。
4、目前对于特定序列的短肽合成主要采用固相肽合成技术，主要将带有氨基保护基团的氨基酸羧基端固定到不溶性树脂上，脱去该氨基酸上的氨基保护基团，同下一个氨基酸活化羧基形成酰胺键，从而将氨基酸通过肽键连接在一起形成肽链，再经过切割、纯化等步骤得到目标短肽。然而，短肽的化学合成法通常需要使用大量的有机溶剂和酸碱试剂，这些试剂可能对人体和环境产生负面影响。其次，化学合成法合成的短肽纯度较低，需要经过多次提纯才能得到高纯度的目标短肽。因此，开发一种短肽的绿色合成方法有利于短肽的合成以及应用。
5、当然，目前也有一些生物合成法制备短肽的方
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种短肽的生物合成方法，采用基因工程菌重组表达合成策略，筛选适当的蛋白标签，并将多种短肽通过适当的linker串联，结合富集提取及特定的纯化方法进行短肽的提纯，降低了合成难度，提高了生产效率，同时减少了杂质的产生。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种短肽的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、将编码目标蛋白的基因序列与his-sumo标签序列融合，并将融合后的序列连接至表达载体上，得到重组表达载体；其中，所述编码目标蛋白的基因序列中含有至少两种短肽的编码序列，且短肽之间通过linker进行连接，所述linker选自dge序列，或以天冬氨酸为n端第一个氨基酸且以谷氨酸为c端第一个氨基酸的序列；
4、s2、将s1的重组表达载体转入宿主细胞中得到重组细胞，发酵培养重组细胞使其表达融合蛋白；
5、s3、从重组细胞中提取融合蛋白，将融合蛋白与sumo蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽蛋白与his-sumo标签，随后将短肽蛋白与aspn蛋白酶和gluc蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽与linker，得到短肽成品。
6、进一步地，在步骤s1中，sumo标签序列如seq id no.1所示(msdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlm eafakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqig)。
7、进一步地，所述目标蛋白含有的短肽包括但不限于kkiiiikk(seq id no.2)或rriiiirr(seq id no.3)中的一种或两种。当只需要获得一种短肽时，该融合肽的构建方式为his-sumo-短肽；当需要同时获得多种短肽时，融合肽的构建方式为两个短肽之间通过linker肽段连接，并在短肽n端连接his-sumo，即his-sumo-短肽1-linker-短肽2。
8、进一步地，在步骤s1中，表达载体可根据宿主细胞的选择来常规确定，包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、ptrc系列、puc系列等载体；所述的pet系列载体包括pet28a、pet29a、pet32a等；所述的duet系列载体包括petduet、prsfduet、pcdfduet等；所述的ptrc系列载体包括ptrc99a等；所述的puc系列载体包括puc18和puc19等。
9、进一步地，在步骤s2中，宿主细胞包括但不限于微生物细胞。如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、假单胞菌等。
10、进一步地，在步骤s2中，所述发酵培养为在适当条件下培养适当时间进行重组表达，当宿主细胞为大肠杆菌时，在种子培养基中于15-42℃下培养6-72h，得到种子液，然后将重组细胞种子液转移至发酵培养基中，于30-40℃下发酵培养。
11、进一步地，在步骤s2中，发酵过程中包括以下步骤：当出现溶氧反弹时，流加补料培养基，补料培养基包含600-800g/l甘油和5-20
12、g/lmgso4·7h2o。
13、进一步地，流加速度为8-12g/l/h。
14、进一步地，种子培养基包括以下组分：酵母粉3-10g/l，蛋白胨5-15g/l，氯化钠5-20g/l。
15、进一步地，发酵培养基包括以下组分：酵母粉10-15g/l、蛋白胨1-20g/l、甘油5-15g/l、na2hpo4·12h2o 6-12g/l、kh2po4 1-5g/l、nh4cl 1-5g/l、na2so4 0.5-1.5g/l、mgso4·7h2o 0.1-1.0g/l，ph6.8-7.0。
16、进一步地，在步骤s3中，所述提取融合蛋白为破碎重组细胞获得上清液后，采用亲和层析法进行提取。具体地，将所述融合蛋白过镍柱，使镍柱与his标签结合固定融合蛋白，随后利用咪唑溶液进行洗脱，得到融合蛋白。
17、进一步地，咪唑浓度为20-500mm。
18、进一步地，在洗脱后还包括对含有融合蛋白的洗脱液进行超滤的步骤，所述超滤为采用超滤膜替换缓冲液为ph7.5-8.5的缓冲液。
19、进一步地，在步骤s3中，当仅含有一种短肽时，将融合蛋白与sumo蛋白酶混合，酶切反应完成后分离目标蛋白与his-sumo标签；当含有多种短肽时，将融合蛋白与sumo蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽蛋白与his-sumo标签，随后将短肽蛋白与aspn蛋白酶和gluc蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽与linker。
20、进一步地，在步骤s3中，两次酶切反应完成后，进一步通过超滤和/或纳滤进行分离和纯化。
21、优选地，在步骤s3中，酶切反应完成后分离短肽蛋白与his-sumo标签本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种短肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述目标蛋白含有的短肽包括SEQ ID NO.2-3中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，宿主细胞包括微生物细胞。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述发酵培养为，在种子培养基中培养得到种子液，将重组细胞种子液转移至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中包括以下步骤：当出现溶氧反弹时，流加补料培养基，补料培养基包含600-800g/L甘油和5-20g/LMgSO4·7H2O。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，流加速度为8-12g/L/h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述提取融合蛋白为破碎重组细胞获得上清液后，采用亲和层析法进行提取。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析法为，将所述上清液过镍柱，使镍柱与His标签结合，然后利用咪唑溶液进行洗脱，得到融合蛋白。
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