【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ngs测序，特别是涉及一种用于提高文库数据均一性的方法及应用。
技术介绍
1、病原学诊断作为感染性疾病诊断至关重要的环节，对感染性疾病精准诊断的价值毋庸置疑。然而，传统原学检测技术存在检测周期长，阳性率低的问题；分子诊断技术存在假阳/阴性、检测范围窄等问题。
2、随着宏基因组学测序技术的普及和推广，宏基因组二代测序技术(metagenomicsnext generation sequencing,mngs)以高通量、覆盖广、无偏倚、快速精准等优势，逐渐用于临床感染性疾病的病原检测，尤其对临床复杂、可疑的呼吸道、血液、无菌体液等感染性样本有重要的临床意义。
3、2014年，mngs被首次用于脑脊液检测钩端螺旋体感染的病例后，国内外对mngs相关研究和文献报道越来越多，并逐渐在临床诊断实践中推广、普及。2016年，mngs检测技术正式在中国临床上开始使用，并迅速成为临床病原微生物精准诊断领域“炙手可热”的焦点。
4、但是，由于混合文库中每个样本的病原载量不同，捕获后的样本间文库浓度产生差异，导致测序后每个样本拆分得到的数据量产生巨大的差异。因此需要一种将捕获后样本进行均一化处理的技术，使下机数据量均一，以保障检测的灵敏度及每个样本的对病原解读的准确性。
技术实现思路
1、针对上述在文库pooling后得到的混合文库中，由于各样本或目标序列含量不同，导致下机数据差异使检测灵敏度下降的问题，本专利技术提供一种用于提高文库数据均一性的方法，采
2、本专利技术提供了一种用于提高文库数据均一性的方法，包括以下步骤：
3、片段化：取样本dna，进行片段化处理，并在断口处连接测序引物；
4、扩增富集：加入1st特异性引物进行pcr扩增，所述1st特异性引物包含接头序列、index序列和互补序列，所述互补序列与所述测序引物互补，所述index序列为该样本的特异性标签序列；
5、pooling：将上述带有index序列的若干样本混合，得到混合样本；
6、均一化扩增：向混合样本中加入等量的2nd特异性引物进行限制性pcr扩增，得到上机文库；所述2nd特异性引物与所述1st特异性引物中的接头序列和index序列互补，且所述2nd特异性引物的加入量小于所有样本充分扩增所需量。
7、上述用于提高文库数据均一性的方法，首先针对每个样本设计了1st特异性引物，带上了针对每个样本的特异性index序列作为标签，制备得到第一文库。随后在均一化扩增步骤中，通过控制2nd特异性引物的浓度、扩增循环数，使用有限量且等量的2nd特异性引物，从每个第一文库序列的index开始扩增，利用限制性扩增方法，在扩增过程中因扩增体系中资源的有限性，不同模版起始的样本的扩增效率不同，在扩增后期，高起始模版样本扩增效率降低、低起始模版样本扩增效率变高，使不同起始量模版的产物质量在扩增后期达到相同的平台期，产生相同浓度水平的pcr产物，以达到产物浓度均一的效果，从而缩短测序数据质量的差异。
8、在一些实施方案中，所述扩增富集步骤中，所述1nd特异性引物在pcr扩增体系中的终浓度为1-2μm/条引物。
9、在一些实施方案中，所述均一化扩增步骤中，每条所述2nd特异性引物在限制性pcr扩增体系中的终浓度为0.05-2μm，优选0.05-1μm，更优选0.1-0.5μm。
10、该终浓度即特异性引物在反应体系中的反应浓度，也可称为工作浓度。此2nd特异性引物的终浓度需控制在目标区域片段最大含量样本充分扩增所需用量以下，从而实现限制性扩增的目的，具体用量可根据实际情况调整。
11、然而，采用上述浓度范围，既能使每对引物得到最佳的扩增，使非等量文库达到最优的均一化效果，又不容易影响酶的活性，形成二级结构，兼顾整个扩增的效果及成本考虑，该浓度范围为较佳的浓度范围。
12、在一些实施方案中，所述pooling步骤和所述均一化扩增步骤之间，还包括捕获步骤，所述捕获步骤为：以rna探针或dna探针，对上述混合样本基因组的目标区域片段进行捕获。可以理解的，上述rna探针或dna探针按照常规设计即可，如可参考文献(baccapseq:aplatform for diagnosis and characterization of bacterial infections.doi:10.1128/mbio.02007-18)进行。
13、在一些实施方案中，所述捕获步骤中，先以生物素标记的rna探针或dna探针对上述混合样本基因组的目标区域片段进行结合，再使用带有链霉亲和素的磁珠，与所述rna探针或dna探针中的生物素结合，对样本进行捕获。可以理解的，上述捕获过程，也可以采用其他抗原抗体结合等方式，或者固相捕获等，按照常规操作即可。但选用极强亲和力的生物素和链霉亲和素配合，比普通抗原与抗体间的亲和力高得多，二者具有结合稳定性好、专一性强、灵敏度高的优势。
14、在一些实施方案中，所述均一化扩增步骤中，从混合样本中取出与样本数相同的若干份，并分别向上述每份样本中加入等量的2nd特异性引物，分别进行限制性pcr扩增，扩增产物pooling后得到上机文库。
15、上述均一化扩增为分管扩增，即将混合样本分为多份，分别与其中一份样本的2nd特异性引物(通过index序列识别区分)扩增，通过加入的2nd特异性引物用量为等量以实现限制性的均一化扩增。
16、在一些实施方案中，所述均一化扩增步骤中，向上述混合样本中加入等量的2nd特异性引物混合物，对混合样本同时进行限制性pcr扩增，即得上机文库。
17、上述均一化扩增为混管扩增，即将混合样本直接与对应每个样本的2nd特异性引物的混合品进行扩增，在同一反应体系中实现限制性的均一化扩增。
18、在一些实施方案中，所述扩增富集步骤中，进行pcr扩增后还包括纯化步骤，所述纯化步骤可以为：采用磁珠分选，得到符合片段大小范围的带有index序列的文库。
19、在一些实施方案中，所述均一化扩增步骤中，进行限制性pcr扩增后还包括纯化步骤，所述纯化步骤可以为：采用磁珠分选，得到符合片段大小范围的带有index序列的文库。
20、可以理解的，上述纯化步骤，按照本领域常规纯化方式即可。
21、在一些实施方案中，所述符合片段大小范围的扩增产物片段长度为100-600bp。
22、在一些实施方案中，所述片段化步骤中，以转座酶打断样本dna，并在断口处连接通用测序引物。可以理解的，对于文库片段化和连接测序引物的方式，可按照本领域通常方法进行即可，如连接接头建库、pcr扩增子建库方法等，但采用转座酶进行，具有低起始量建库、建库时长短的优势。
23、在一些实施方案中，所述扩增富集步骤中，所述pcr扩增中，按照如下过程扩增：98℃保持30s后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于提高文库数据均一性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于提高文库数据均一性的方法，其特征在于，所述扩增富集步骤中，所述1st特异性引物在PCR扩增体系中的终浓度为1-2μM/条引物；
3.根据权利要求1所述的用于提高文库数据均一性的方法，其特征在于，所述Pooling步骤和所述均一化扩增步骤之间，还包括捕获步骤，所述捕获步骤为：以RNA探针或DNA探针，对上述混合样本基因组的目标区域片段进行捕获。
4.根据权利要求3所述的用于提高文库数据均一性的方法，其特征在于，所述捕获步骤中，先以生物素标记的RNA探针或DNA探针对上述混合样本基因组的目标区域片段进行结合，再使用带有链酶亲和素的磁珠，与所述RNA探针或DNA探针中的生物素结合，对样本进行捕获。
5.根据权利要求1所述的用于提高文库数据均一性的方法，其特征在于，所述均一化扩增步骤中，从混合样本中取出与样本数相同的若干份，并分别向上述每份样本中加入等量的2nd特异性引物，分别进行限制性PCR扩增，扩增产物Pooling后得到上机文库；
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