【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种全新的、用于合成d-泛解酸生物催化剂和方法。
技术介绍
1、d-泛解酸是一种重要的原料药中间体，在酸性条件下可自发环化形成d-泛解酸内酯，是用于维生素b5，d-泛解酸钙等药物合成的主要原料。d-泛解酸的合成有化学法和酶法，但均存在制备过程繁琐，成本高，效率低，而且原料毒性较大、成本高、废水不易处理的问题。现有的化学法合成泛解酸是以d和l构型的泛解酸内酯混旋物作为底物，需要通过繁琐的化学工艺和大量的有机溶剂进行拆分，仅一半构型的化合物能用于目标产物的纯化，成本高且不环保。现有酶法采用的是通过水解酶将混旋的dl-泛解酸内酯中的d-泛解酸内酯选择性的水解成d-泛解酸，从而达到d和l构型产物的分离。其过程复杂，效率低，产品比旋低，成本高，并需用毒性较高的氰化钠，废水不易处理，不适合产业化。
2、本专利技术公开了一种全新的d-泛解酸酶法合成路径。解决了现有技术存在的工艺繁琐，效率低，成本高，产业化后会造成环境污染等问题。
3、本专利技术以酮泛解酸为底物，该底物在酮还原酶(keto reductase，简称kred)或酮泛解酸还原酶(ketopantoate reductase，简称kpr)的催化下发生不对称还原反应生成目标手性产物d-泛解酸。所述反应在ph6.0-9.0、温度为20-60℃的水相磷酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液溶液中进行。采用本专利技术的酶法路径制备d-泛解酸，其产物手性纯度极高，且操作简单，转化率高，反应条件温和，污染少。
4、在反应机理上，酮还原酶或酮泛
5、本申请用甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，简称fdh)，以甲酸为底物，将辅酶因子nad+循环为nadh，所产生的产物为co2，无固废产物生成；传统的葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase，简称gdh)以葡萄糖为底物将辅酶因子nad+循环为nadh的同时所产生的葡萄糖酸为工业固废；本申请提供的技术方案消除了固废的生成，开创了更为环保的酶法合成途径。
6、在酮还原酶或酮泛解酸还原酶将酮泛解酸催化反应生成目标手性产物d-泛解酸的过程中，在上述提及的成本以及环保问题之外，最关键的是还原酶催化底物转化为目标产物的能力。然而可用于上述反应的还原酶来源较少、催化活性往往不能满足工业生产的需要，限制了在工业上的大规模应用。
7、本申请提供的经定向进化改造后的工程化酮还原酶多肽与seq id no：2对应的野生型的酮还原酶相比，具有更好的活性和稳定性，能够以极高的立体选择性不对称地、特别是更高效地催化酮泛解酸转化为d-泛解酸，并已可用于工业化生产。
技术实现思路
1、1.概论
2、本专利技术提供了一种立体选择性高、催化活性高、稳定性好、底物耐受性高的工程化酮还原酶多肽，能够用于制备手性产物d-泛解酸。还提供了工程化酮还原酶多肽的基因，含有该基因的重组表达载体，工程菌株及其高效制备方法，以及使用工程化酮还原酶多肽制备d-泛解酸的反应工艺。
3、在一些实施方案中，本公开内容中改进的酮还原酶多肽能够以大于seq id no：2的活性将酮泛解酸还原生成d-泛解酸。本专利技术提供的改进的工程化酮还原酶多肽与seq idno：2对应的野生型的酮还原酶相比，具有更高的活性、稳定性和底物耐受性，能够更高效地催化酮泛解酸还原生成d-泛解酸；在高底物浓度下，本专利技术提供的改进的工程化酮还原酶多肽仍然能够不被抑制地催化将酮泛解酸还原生成d-泛解酸。这些改进的酮还原酶多肽可包括在对应以下的残基位置与seq id no：2序列相比的一个或多个残基差异的氨基酸序列：x8，x11，x28，x30，x37，x38，x70，x74，x96，x124，x132，x240，x254，x270。改进的酮还原酶多肽包括包含以下特征至少之一的氨基酸序列：c8p，l11m，g28a，l30t，c37f，s38p，t70c，w74p，w74f，i96m，r124h，r124q，r124s，r124k，r124n，v132k，v132t，e240d，h254r，h254p，h254k，h254e，a270v；或同时在这些差异的基础上，包含一个或更多个氨基酸残基的插入或缺失。
4、更具体的，在一些实施方案中，在seq id no：2基础上改进的工程化酮还原酶多肽包括对应seq id no：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124所示氨基酸序列组成的多肽。
5、在一些实施方案中，改进的工程化酮还原酶多肽包括与seq id no：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124的参考序列至少97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，酮还原酶多肽催化酮泛解酸生成d-泛解酸，所述多肽包括具有与参考序列seq id no:2至少97％的序列同一性和与seq id no:2相比在残基位置132、254上的至少一个残基差异的氨基酸序列，其中，在残基位置132上的氨基酸残基选自k，在残基位置254上的氨基酸残基选自p，所述多肽具有高的活性、稳定性和底物耐受性，且产物ee值至少99％。
6、两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得到，可采用ncbi blastp和blastn软件根据默认参数计算得到，也可采用采用clustal w算法(nucleic acid research,22(22):4673-4680,1994)。
7、在另一方面，本专利技术提供了编码工程化酮还原酶多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸可以是具有用于表达工程化酮还原酶多肽的一种或多种控制序列的表达载体的部分。在一些实施方案中，多核苷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化酮还原酶多肽，催化酮泛解酸还原生成D-泛解酸，且ee值至少99％,所述多肽包括具有与参考序列SEQ ID NO:2至少97％的序列同一性和与SEQ ID NO:2相比在残基位置132、254上的至少一个残基差异的氨基酸序列，其中，在残基位置132上的氨基酸残基选自K，在残基位置254上的氨基酸残基选自P。
2.根据权利要求1所述的多肽，反应条件包括约1g/L-200g/L的酮泛解酸钠，0.1g/L至10g/L工程化多肽的载量，6.0至9.0的pH，20-60℃的温度。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID No 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124所示的氨基酸序列。
4.一种通过化学键或物理吸附的方法被固定在固体材质上的多肽，所述多肽选自权利要求1-3任一项所述的酮还原酶多肽。
5.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一项的多肽。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列为对应SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123。
7.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求5-6所述的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的表达载体，所述表达载体包括质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求7-8任一项的表达载体，所述宿主细胞优选大肠杆菌(E.coli)。
10.一种酮还原酶多肽的制备方法，其包括如下步骤：培养权利要求9所述的宿主细胞，以及从培养物中获得酮还原酶多肽。
11.一种酮还原酶催化剂，其选自权利要求7-10任一项的培养物，通过从培养物中获得的含酮还原酶多肽的宿主细胞或培养液，或者用其加工的制品；其中，所述制品是指由转化体细胞得到的提取物，通过对提取物中的酮还原酶进行分离或纯化得到的分离产品，或通过固定化转化体细胞及其提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品。
12.一种制备D-泛解酸的方法：
13.如权利要求12所述的方法，其中所述反应条件包括20℃至60℃的温度。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述反应条件包括pH6.0至pH9.0。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述底物以1g/L至200g/L的载量存在。
...【技术特征摘要】
1.一种工程化酮还原酶多肽，催化酮泛解酸还原生成d-泛解酸，且ee值至少99％,所述多肽包括具有与参考序列seq id no:2至少97％的序列同一性和与seq id no:2相比在残基位置132、254上的至少一个残基差异的氨基酸序列，其中，在残基位置132上的氨基酸残基选自k，在残基位置254上的氨基酸残基选自p。
2.根据权利要求1所述的多肽，反应条件包括约1g/l-200g/l的酮泛解酸钠，0.1g/l至10g/l工程化多肽的载量，6.0至9.0的ph，20-60℃的温度。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为seq id no 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124所示的氨基酸序列。
4.一种通过化学键或物理吸附的方法被固定在固体材质上的多肽，所述多肽选自权利要求1-3任一项所述的酮还原酶多肽。
5.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一项的多肽。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列为对应seq id no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29...
【专利技术属性】
技术研发人员：张迎新，章兆琪，赵苏安，蔡冰钦，陈承，许俊鹏，张城孝，陈海滨，
申请(专利权)人：宁波酶赛生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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