【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种多顺反子的自放大rna及制备方法。
技术介绍
1、mrna疫苗大致分为非复制性mrna疫苗和自放大rna疫苗。与非复制性mrna疫苗相比，自放大rna（self-amplifying rna，sarna）能够以自身的rna序列为模板，进行自我复制。较低剂量的sarna可以实现相似的免疫原蛋白表达水平和对病毒的同等保护效力。此外使用较低剂量的sarna将最大限度地减少递送材料（如阳离子脂质体）的使用，从而有助于控制成本和潜在的副作用。
2、sarna相对于传统的mrna的长度更长，可达9-12 kb。这是因为除了最基本的mrna元件，例如帽子、5'utr、3'utr、polya尾，sarna还包含一个的源于alphavirus的非结构蛋白(non-structural protein)序列和一个位于目标基因（gene of interest，goi）上游的26s亚基因组启动子(subgenomic promoter，sg-promoter)，非结构蛋白(non-structuralprotein)序列编码来自病毒的4种非结构蛋白（nsp1，nsp2，nsp3，nsp4），结构参见图4中的a。病毒结构蛋白的缺失使 sarna 无法产生传染性病毒。在递送至细胞的胞质溶胶中后，释放的 sarna 具有翻译能力，并与宿主细胞核糖体结合以产生 rna 依赖性 rna 聚合酶（rdrp）或病毒基因组复制装置的四个功能组分：nsp1、nsp2、nsp3 和 nsp4。
3、如图1所示，sa
4、多顺反子常常存在于原核生物中，一个转录本，可以翻译出多个蛋白。而真核生物，则多利用单顺反子策略。在分子克隆中，我们可以模拟原核生物的这一特点，在真核生物之中使用多顺反子元件，将多个开放阅读框（open reading frame，orf）串联起来，同时表达多个基因。目前，真核细胞中广泛采用的是ires（internal ribosome entry site，ires)元件或自剪切多肽2a(self-cleaving 2a peptide，2a)元件。ires元件具有不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能，进而可以启动下游基因的翻译。但是，ires有一个主要的缺点，与上游顺反子相比，下游顺反子的表达水平比较低（通常为上游的10 %-20 %）。为了克服ires元件的一些缺点，科学家们将自剪切多肽2a改造到了多顺反子载体中。这些短肽被认为是通过使核糖体跳过2a元件c端肽键的合成来发挥作用的，由于其独特的“剪切”机制,导致最终分别得到一个融合有2a肽尾巴的上游蛋白和一个n端带有一个脯氨酸的下游蛋白。2a元件的优点是顺反子属于同一编码框架，表达强度趋于一致。但其缺点是会在目标蛋白的n端或c端增加额外的2a肽残留序列，这可能会对目的蛋白的功能造成一定的影响。但由于ires和2a肽两者各自存在的优缺点，在体外实验中人们有时仍需要寻找新方法来进行多顺反子的表达。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种多顺反子自放大rna，其结构如式（i）所示：
2、（i）
3、其中，sgp-n单元与goi-n单元组成重复框架，n为大于1的整数，且utr单元、nsp1234/sgp-1单元、重复框架内的各sgp-n单元的序列均来源于甲病毒。
4、本专利技术提供的重复框架，是指sgp单元与goi单元的组合，本专利技术提供的自放大rna，其中第一个sgp-1单元的5'端部分与nsp1234的3'末端部分重合，即第一个sgp-1单元与nsp1234单元存在部分重叠序列，除了与nsp1234重叠的sgp-1及与之相连的goi-1单元以外，sgp-n单元与goi-n单元则相互独立并以串联的形式存在，因此sgp-n单元与goi-n单元的组合被称为重复框架，但是每个重复框架的内的具体序列可以不相同。在一些实施方式中，自放大rna包含一个重复框架，即重复框架1（含sgp+goi-2），其中goi-1和goi-2分别表达不同的蛋白质。在一些实施方式中，自放大rna包含两个重复框架，分别是重复框架1（含sgp+goi-2）和重复框架2（含sgp+goi-3），其中goi-1、goi-2和goi-3分别表达不同的蛋白质。在一些实施方式中，自放大rna包含三个重复框架，分别是重复框架1（含sgp+goi-2），重复框架2（含sgp+goi-3），和重复框架3（含sgp+goi-4），其中goi-1、goi-2，goi-3和goi-4分别表达不同的蛋白质。sgp-1和sgp-n中的“-1”和“-n”用于标记sgp单元在式（i）中的序号，对goi单元也是如此。
5、本专利技术提供的多顺反子自放大rna（polycistronic / multicistronic self-amplifying rna, psarna / msarna），其中各单元的序列除nsp1234的3'末端和第1个sgp单元的5'端部分重合外，其他序列均相互独立。
6、甲病毒（alphavirus）是一类由蚊虫等节肢动物传播的、有囊膜、单链、正义rna病毒，属于披膜病毒科（togaviridae），能广泛感染人、鸟、鼠、马等多种动物并引起相关疾病，如委内瑞拉马脑炎病毒（venezuelan equine encephalitis virus，veev）、森林脑炎病毒（semliki forest virus，sfv）和辛德毕斯病毒( sindbis virus, sinv) 等。
7、本专利技术设计的多顺反子自放大rna（polycistronic / multicistronic self-amplifying rna, psarna / msarna），在保留传统单顺反子sarna自放大效果的同时，能够在一条rna链上进行多顺反子rna的独立自放大和蛋白表达。该方法简单易行，可以定制化无差别的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多顺反子自放大RNA，其结构如式（I）所示：
2.如权利要求1所述的自放大RNA，其中，所述n为2-5中的任意一个整数。
3.如权利要求1所述的自放大RNA，其中，所述甲病毒选自VEEV、SFV和SINV。
4.如权利要求1所述的自放大RNA，其中，所述UTR单元、所述nsP1234/SGP-1单元、所述各SGP单元的序列均来源于同一甲病毒。
5.如权利要求1所述的自放大RNA，其中，所述UTR单元、所述nsP1234/SGP-1单元、所述各SGP单元中至少一个单元的甲病毒来源与其它单元不同。
6.如权利要求1所述的自放大RNA，其中，所述GOI-1单元与所述重复框架内的各GOI-n单元分别为不同的目的基因。
7.如权利要求1所述的自放大RNA，其中，
8.一种质粒，包括权利要求1至权利要求7中任意一项所述的自放大RNA的编码序列。
9.如权利要求8所述的质粒，其中，所述质粒在所述自放大RNA的编码序列上游还包含T7启动子。
10.如权利要求9所述的质粒，其中，所述
11.权利要求1至权利要求7任意一项所述的自放大RNA的制备方法，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种多顺反子自放大rna，其结构如式（i）所示：
2.如权利要求1所述的自放大rna，其中，所述n为2-5中的任意一个整数。
3.如权利要求1所述的自放大rna，其中，所述甲病毒选自veev、sfv和sinv。
4.如权利要求1所述的自放大rna，其中，所述utr单元、所述nsp1234/sgp-1单元、所述各sgp单元的序列均来源于同一甲病毒。
5.如权利要求1所述的自放大rna，其中，所述utr单元、所述nsp1234/sgp-1单元、所述各sgp单元中至少一个单元的甲病毒来源与其它单元不同。
6.如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晟，赵志康，孙秀莲，
申请(专利权)人：南京鸿明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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