本发明专利技术公开了一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β－内酰胺酶的方法，涉及一种光纤生物传感器，其包括光学系统、电子学系统、数据采集系统及控制与处理系统，其还包括光纤和传感器，其中光纤材料为聚苯乙烯，传感器上设有敏感膜，敏感膜上含有利用戊二醛固定的Ｃｙ５标记的β－内酰胺酶单克隆抗体。该单克隆抗体通过以β－内酰胺酶为抗原免疫小鼠，细胞融合等过程制备。本发明专利技术具有高灵敏度、抗电磁辐射、抗电子频率干扰、抗腐蚀性，且仪器体积小，方便携带，所需检测样品少，响应时间快，易于操作和成本低廉等优点。可广泛用于液态牛奶、奶粉、固体样品等乳制品中β－内酰胺酶的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品3 -内酰胺酶的方法，属于生物技术 领域。技术背景解抗剂学名(3-内酰胺酶，它是针对P-内酰胺类抗生素提炼出来的一种化学品，是一种 抗生素分解剂，它能有效分解牛奶中残留的抗生素。P-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添 加剂，该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。但是为了追求利益， 一些商贩使用它来 降解掉牛乳中残留的抗生素，生产所谓的人造无抗奶，致使抗生素酶解后的残留物进入乳 制品，对人体健康造成伤害，同时它也能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉 素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费 者的身体健康带來危害。因此，迫切需要快速的检测方法，从而能准确的检测乳制品中(3-内 酰胺酶。目前，国内常用的牛奶中的抗生素检测主要依据GB方法进行，此方法操作比较简便， 比较适合基层单位使用，但是存在着灵敏度较低、操作误差较大等问题，比如TTC显色时 间的掌握和目测、菌种的保存和接种量等。也有相关机构采用产生头孢素法来检测牛奶中的 卩-内酰胺酶，这种方法灵敏度相对较高，但是能够检测的P-内酰胺酶的类别比较少，实用性较差。生物传感器是以生物化学和传感技术为基础，用酶、抗体、细胞等生物活性物质作为分 子识别元件，配上信号转换器和电子测量仪所构成的分析工具。生物传感器具有准确、灵敏、 易操作和可重复使用等优点。其中光纤传感器是一种光电转换设备，抗腐蚀、抗电磁辐射和 电子频率干扰，同时光纤低衰减率的高质量传输可实现对危险地区的远距离检测。由于光纤 传感器的上述特点，其在食品安全检测控制领域的应用有着广阔的前景。利用生物传感器，特别是光纤生物传感器检测乳制品中(3-内酰胺酶的方法，还未见有此 类专利报道。本专利技术专利利用生物传感器技术建立了一种快速检测乳制品中P-内酰胺酶方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供--种用于检测p-内酰胺酶的光纤生物传感器。该传感器是由光学 系统、电子学系统、数据采集系统及控制与处理系统组成。所用的光纤材料为聚苯乙烯。 本专利技术的另一个目的在于提供一种利用光纤生物传感器检测P-内酰胺酶的方法，其检测在光纤表面加上载有(3-内酰胺酶抗体的生物敏感元件，当倏逝波穿过生物敏感元件时，或产生光信号，或导致倏逝波与光纤内传播光线的强度、相位或频率的改变，而测量这些变 化，即可获得生物敏感元件上变化的信息。本专利技术所述的一种利用光纤生物传感器检测(3-内酰胺酶的方法，具体包括以下歩骤所述的P-内酰胺酶抗体制备取(3-内酰胺酶100pg、卡介苗5mg，与等体积佛氏完全佐剂 研磨后注入6周龄雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔周腹腔注射5次，融 合前3天腹腔注射50 pgP-内酰胺酶标准溶液，以50。/。PEG4000为融合剂，将小鼠脾细胞与NS1 细胞融合，IMDM2HAT选择培养，2周后换HT培养液培养。以p-内酰胺酶为抗原，经间接ELISA 法筛选阳性克隆后的杂交瘤细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入BALBPC小 鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测(3-内酰胺酶抗体；所述的抗体包被液为0.02 mol/L的Na2CO3和0.04 mol/L的NaHC03溶液，pH值为9.6;所述的稀释液为0.5。/。的干酪素和0.01 mol/L的PBS， pH值为9.6;所述的清洗液为0.02mol/L磷酸盐，0.05。/。的TritonX-100和0.1 g/L的NaN;， pH值为7.2; 所述P-内酰胺酶标准溶液的配制取一定量的(3-内酰胺酶，配制为浓度分别为0、 5、 10、 50、 100和200昭/L的标准溶液；所述包被抗体的制备用包被液将p-内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入4'C孵育12 16h,然后可用于相应的免疫反应。暂时不用时可置4。C保存；所述标记抗体的制备将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Cy5结合后，通过凝胶过滤分离到标记了Cy5的单克隆抗体。所述抗体固定的制作通过三氨基丙基三乙基硅垸等硅垸类物质将光纤表面硅垸化，然 后借助双功能交联剂戊二醛将标记了Cy5的P-内酰胺酶单克隆抗体进行固定。所述标准曲线的制作将标记了Cy5的p-内酰胺酶单克隆抗体固定到活化器上，放入光纤 生物传感器，取一定量的不同浓度的(3-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感 器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，约300s后，将检测结果进行显示和保存。 记录不同浓度的P-内酰胺酶标准溶液所对应的光信号值，制作标准曲线。所述乳制品中P-内酰胺酶的检测方法进行测试时，可直接将经过适当预处理的样品放 入光纤生物传感器进行测试，根据所测得的光信号，对照标准曲线，即可求出样品中IB-内酰 胺酶的浓度。与现有技术相比，本专利技术具有如下的积极效果(1) 本专利技术首次公开了一种光纤生物传感器，可用于检测乳制品中的(3-内酰胺酶；(2) 抗原-抗体特异性结合决定了该光纤生物传感器的高灵敏度，不受其他干扰，降低了检出下限，且该光纤传感器具有抗电磁辐射、抗电子频率千扰、抗腐蚀等优点；(3) 体积小，方便携带，且所需检测样品少；(4) 使用荧光取代了放射性物质，响应时间快，易于操作和成本低廉。 具体实施例本专利技术的内容可通过以下实施例作进一歩详细阐述，但不以任何方式限制本专利技术的范围。 实施例1卩-内酰胺酶抗体制备取P-内酰胺酶IOO pg、卡介苗5mg，与等体积佛氏完全佐剂研磨后注入6周龄雌性BALBPC 小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50路(3-内酰胺 酶标准溶液，以50% PEG4000为融合剂，将小鼠脾细胞与NS1细胞融合，IMDM2HAT选择培 养，2周后换HT培养液培养。以(3-内酰胺酶为抗原，经间接EUSA法筛选阳性克隆后的杂交瘤 细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入BALBPC小鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗 鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测(3-内酰胺酶抗体，制备(3-内酰胺酶抗体。实施例2(1) 包被抗体的制备用包被液将P-内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入4'C孵育12 16 h，然后可用于相应的免疫反应。暂时不用时可置4。C保存。(2) 标记抗体的制备将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Cy5结合后， 通过凝胶过滤分离到标记了Cy5的单克隆抗体。(3) 抗体固定的制作通过三氨基丙基三乙基硅烷等硅垸类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊 二醛将标记了Cy5的p-内酰胺酶单克隆抗体进行固定。(4)具体实施方式将标记了Cy5的P-内酰胺酶单克隆抗体固定到活化器上，放入光纤生物传感器，检测时， 取一定量预处理好的样品或(3-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到 系统接口中，按下测试键，响应一段时间后，将检测结果进行显示和保存。记录不同样品溶 液所对应的光信号值。实施例3(1)标准曲线的制作取一定量的不同浓度的P-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，约3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β－内酰胺酶的方法，其步骤为： （１）β－内酰胺酶抗体的制备 取β－内酰胺酶１００μｇ、卡介苗５ｍｇ，与等体积佛氏完全佐剂研磨后注入６周龄雌性ＢＡＬＢＰＣ小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔 周腹腔注射５次，融合前３天腹腔注射５０μｇ β－内酰胺酶标准溶液，以５０％ＰＥＧ４０００为融合剂，将小鼠脾细胞与ＮＳ１细胞融合，ＩＭＤＭ２ＨＡＴ选择培养，２周后换ＨＴ培养液培养。以β－内酰胺酶为抗原，经间接ＥＬＩＳＡ法筛选阳性克隆后的杂交瘤细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入ＢＡＬＢＰＣ小鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测β－内酰胺酶抗体。 （２）包被抗体的制备 用包被液将β－内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入，４℃ 孵育１２～１６ｈ，４℃保存备用。 （３）标记抗体的制备 将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Ｃｙ５结合后，通过凝胶过滤分离到标记了Ｃｙ５的单克隆抗体。 （４）固定抗体的制备 将通过三氨基丙 基三乙基硅烷等硅烷类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊二醛将标记了Ｃｙ５的β－内酰胺酶单抗进行固定。 （５）标准曲线的制作 将标记了Ｃｙ５的β－内酰胺酶单抗固定到活化器上，放入光纤生物传感器，取一定量的不同浓度的β－内 酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，约３００ｓ后，将检测结果进行显示和保存。记录不同浓度的β－内酰胺酶标准溶液所对应的光信号值，制作标准曲线。 （６）样品的检测 取一定量的待 测样品滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，待数据稳定后，记录并保存测得信号值，对照β－内酰胺酶标准曲线，得出样品中β－内酰胺酶的含量。...
【技术特征摘要】
1.一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，其步骤为(1)β-内酰胺酶抗体的制备取β-内酰胺酶100μg、卡介苗5mg，与等体积佛氏完全佐剂研磨后注入6周龄雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50μg β-内酰胺酶标准溶液，以50％PEG4000为融合剂，将小鼠脾细胞与NS1细胞融合，IMDM2HAT选择培养，2周后换HT培养液培养。以β-内酰胺酶为抗原，经间接ELISA法筛选阳性克隆后的杂交瘤细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入BALBPC小鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测β-内酰胺酶抗体。(2)包被抗体的制备用包被液将β-内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入，4℃孵育12～16h，4℃保存备用。(3)标记抗体的制备将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Cy5结合后，通过凝胶过滤分离到标记了Cy5的单克隆抗体。(4)固定抗体的制备将通过三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊二醛将标记了Cy5的β-内酰胺酶单抗进行固定。(5)标准曲线的制作将标记了Cy5的β-内酰胺酶单抗固定到活化器上，放入光纤生物传感器，取一定量的不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏...
【专利技术属性】
技术研发人员：张建中，赵晓联，赵春城，徐祖奇，杨婷婷，蔡建荣，马祯婉，
申请(专利权)人：无锡益达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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