酸性芦荟多糖及其制备纯化方法和应用技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体涉及一种酸性芦荟多糖的制备、纯化以及其在抗幽门螺旋杆菌及大肠杆菌药物中的应用。实验证明，本发明专利技术所涉及的以中华芦荟为原料，采用热水提取，乙醇沉淀的方法得到粗提物，通过热水溶解，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀后得到粗多糖，再经过ＤＥＡＥ－５２离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖的方法具有产物纯度高、产率较大、设备要求简单、重现性较好的特点（见摘要附图）。本发明专利技术的酸性芦荟多糖可以有效降低幽门螺旋杆菌对ＭＫＮ？４５细胞黏附率。此外，对于大肠杆菌黏附ＬＯＶＯ细胞也有显著的抑制作用。说明此酸性芦荟多糖是一种广谱的抗黏附剂，并可以在制备抗幽门螺旋杆菌黏附药物以及治疗幽门螺旋杆菌感染引起的相关疾病中应用。？

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，具体涉及酸性芦荟多糖的制备、纯化以及在制备抗幽门螺旋杆菌黏附药物和治疗幽门螺旋杆菌引起的相关疾病中的应用。二
技术介绍
芦荟自古以来就被作为一种药食两用植物而广泛应用。现代药理研究表明芦荟具 有杀菌、消炎、泻下、抗氧化、抗辐射、抗溃疡以及抗肿瘤等作用。据国内外的研究报道，芦 荟所含的活性成分有两大类，一类是存在于芦荟叶片底部及表皮附近的芦荟素等蒽醌类物 质，另一类是从芦荟鲜叶薄壁管胞中分离出的芦荟凝胶，其中约98. 5%是天然水分，而碳水 化合物——粘多糖则约占总固体量的60%以上。作为芦荟凝胶的主要有效成分之一的芦荟 多糖，其药理学研究也逐渐活跃。近年来的研究表明，芦荟多糖具有抗衰老、抗辐射、抗胃溃疡、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用。因此，芦荟多糖对于这些相关疾病具有潜在的预防或治疗作用。但目前尚未见其在抵抗幽门螺旋杆菌等细菌黏附方面的研究报道。 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种革兰氏阴性、S形或弧形弯曲的细菌。许多证据显示胃十二指肠疾病和幽门螺杆菌之间有紧密联系，可诱发人类的慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关性淋巴样组织淋巴瘤、肠性胃癌。世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为I类致癌物，它是胃癌的主要诱发因子。目前幽门螺旋杆菌的治疗方案主要是采用三联疗法，但随着抗生素的广泛应用，耐药菌株的发生率逐渐增加导致治疗失败。 研究证明，细菌对宿主细胞的黏附是引起后期一系列病理变化并引发相关疾病的关键步骤。抗黏附剂可阻断这一关键步骤，从而预防和治疗细菌感染造成的疾病。与传统杀菌剂相比，抗黏附剂不直接杀死细菌，这样就有效防止了耐药菌株的产生。本专利技术中的酸性芦荟多糖阻断幽门螺旋杆菌与宿主细胞的黏附过程，与传统的抗菌治疗相比具有不易产生耐药菌株的特点，是一种治疗或预防幽门螺旋杆菌引起的相关疾病的新手段。同时，它也可以抑制大肠杆菌的黏附，显示出一定的广谱抗黏附效果。三
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题 本专利技术致力解决酸性芦荟多糖的制备、纯化以及在制备抗幽门螺旋杆菌黏附药物 和治疗幽门螺旋杆菌感染引起的相关疾病中的应用。 本专利技术的技术方案 (1)本专利技术所述的酸性芦荟多糖，是采用水提醇沉法从中华芦荟中提取并经 DEAE-52阴离子交换树脂纯化的方法制备得到，其分子量约为29. 39KDa，单糖组成主要有 37%半乳糖、15.3%阿拉伯糖、9%鼠李糖、7. 1%甘露糖、3.7%葡萄糖以及1.4%木糖，并含 有25.6%的糖醛酸； (2)酸性芦荟多糖制备纯化方法是以中华芦荟为原料，采用热水提取，乙醇沉淀的 方法得到粗提物，通过热水溶解，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀后得到粗多糖。再经过DEAE-52离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖； (3)本专利技术中的酸性芦荟多糖可以显著降低幽门螺旋杆菌对MKN 45细胞的黏附 率，并呈一定的剂量相关，可在开发抗幽门螺旋杆菌黏附药物以及治疗幽门螺旋杆菌感染 引起的相关疾病中应用。 (4)本专利技术中的酸性芦荟多糖还可以显著降低大肠杆菌对LOVO细胞的黏附率， 显示本专利技术中的多糖具有广谱的抗黏附效果，可以在制备针对其他细菌的抗黏附药物中应 用。 本专利技术与现有技术相比，其有益效果是 (1)本专利技术以中华芦荟为原料，采用热水提取，乙醇沉淀的方法得到粗提物，通过 热水溶解，三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀后得到粗多糖。再经过DEAE-52离子交换柱层析纯化 得到酸性芦荟多糖，该方法具有产物纯度高、产率较大、设备要求简单、重现性较好的特点， 为酸性芦荟多糖的进一步应用提供了基础和依据； (2)本专利技术以制备的酸性芦荟多糖为研究对象，综合运用药理学、生物学方法，揭 示了酸性芦荟多糖可以显著降低幽门螺旋杆菌对MKN 45细胞的黏附率，并呈一定的剂量 相关，可在开发抗幽门螺旋杆菌及大肠杆菌黏附药物中应用。并能成为一种潜在的抗细菌 黏附药物。 (3)此外，本专利技术中的酸性芦荟多糖还可以显著降低大肠杆菌对LOVO细胞的黏附 率，显示本专利技术中的多糖具有广谱的抗黏附效果。并能成为一种潜在的广谱性抗黏附药物。四附图说明 图1 :酸性芦荟多糖提取、分离及纯化流程图。 图2 :酸性芦荟多糖对幽门螺旋杆菌黏附MKN45细胞的抑制效果。对照组未经酸 性芦荟多糖处理，其幽门螺旋杆菌黏附率作为100%。其他组分别与对照组相比，得到相对 黏附率(％)。数据经过T检验，与对照组相比，p〈0.05被认为存在显著性差异。其中， *p < 0. 05， **p < 0. 01， ***p < 0. 001。图3 :酸性芦荟多糖对大肠杆菌黏附LOVO细胞的抑制效果。对照组未经酸性芦荟多糖 处理，其大肠杆菌黏附率作为100%。其他组分别与对照组相比，得到相对黏附率(％ )。数 据经过T检验，与对照组相比，p < 0. 05被认为存在显著性差异。其中，< 0. 001。五具体实施例方式通过以下实施例进一步详细说明本专利技术，但应注意本专利技术的范围并不受这些实施例的任何限制。 材料与来源 试剂乙醇(南京化学试剂公司)；苯酚(天津市化学试剂一厂)；三氯乙酸(上海 凌峰化学试剂有限公司)；硫酸(南京化学试剂有限公司)；FITC (SIGMA公司)；氯化钠(南 京化学试剂公司)；1640培养基(Gibco公司)；Columbia培养基(biom6rieux， France);琼 脂粉(上海医药化工集团)；酵母浸膏(南京大治生物技术有限公司)。 材料幽门螺旋杆菌(美国菌种保存中心)；大肠杆菌(南京大学功能生物分子研 究所)。 器材UV-2201紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；BSZ-IOO自动部份收集器(上海 沪西分析仪器厂有限公司)；酶标仪(TECAN公司)。 实施例1酸性芦荟多糖的制备和纯化 (1)新鲜的芦荟叶片切碎后，经过热水提取，乙醇沉淀后得到粗提物。称取适量的 粗提物，用50 70 %乙醇浸泡两次，每次24 48h，残渣挥干溶剂后，搅拌溶于适量蒸馏 水，离心除去不溶物质。上清液中加入三氯乙酸除蛋白，静置过夜后离心取上清，重复上述 操作。上清减压浓縮后加入95%乙醇静置过夜后离心，沉淀烘干后得白色或浅黄色块状固 体，即为芦荟粗多糖。 (2)芦荟粗多糖经过离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖。采用DEAE-52阴离 子交换树脂，首先使用蒸馏水洗脱，之后采取O. 1 0. 4M NaCl洗脱，收集洗脱液，苯酚硫酸 法测定每管洗脱液中多糖含量，合并洗脱液，浓縮、透析、冻干即得本专利技术的精制酸性芦荟 多糖。该法重现性好、产率稳定，可为后续试验提供样品。流程图见附图l。 实施例2酸性芦荟多糖对幽门螺旋杆菌黏附MKN 45细胞的抑制作用 (1)幽门螺旋杆菌划线法接种在哥伦比亚琼脂培养基上(含有7%新鲜羊血)，于37t:微需氧环境下培养3天。之后刮取菌落置于灭菌的生理盐水中，调菌液为适当浓度。向调制好浓度的菌液中加入FITC-DMS0溶液，室温孵育1 3h。然后将标记好的菌悬液离心，倒出上清，加入含有吐温-20的D-Hanks溶液反复吹打数次，继续离心，重复以上操作2次，洗去未标记上的FITC。 (2)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酸性芦荟多糖，其特征是采用水提醇沉法从中华芦荟中提取并经ＤＥＡＥ－５２阴离子交换树脂纯化的方法制备得到的酸性芦荟多糖，分子量约为２９．３９ＫＤａ，单糖组成主要有３７％半乳糖、１５．３％阿拉伯糖、９％鼠李糖、７．１％甘露糖、３．７％葡萄糖以及１．４％木糖，并含有２５．６％的糖醛酸。

【技术特征摘要】
一种酸性芦荟多糖，其特征是采用水提醇沉法从中华芦荟中提取并经DEAE-52阴离子交换树脂纯化的方法制备得到的酸性芦荟多糖，分子量约为29.39KDa，单糖组成主要有37％半乳糖、15.3％阿拉伯糖、9％鼠李糖、7.1％甘露糖、3.7％葡萄糖以及1.4％木糖，并含有25.6％的糖醛酸。2. 根据权利要求1所述酸性芦荟多糖的制备纯化方法，其特征是由以下步骤构成(1) 新鲜的芦荟叶片切碎后，经过热水提取，乙醇沉淀后得到粗提物，芦荟多糖粗提物， 用50 70%乙醇浸泡2次，每次24 48h，残渣挥干溶剂后，溶于蒸馏水中，离心除去不溶 物质，上清液中加入三氯乙酸除蛋白，静置过夜后离心取上清，并重复上...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐琛，阮小明，李洪森，郭彬歆，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]