【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种以泛硫醇为底物催化硫酯形成的连接酶及其应用。
技术介绍
1、硫醇是acp结构域(酰基载体蛋白)中一个特定丝氨酸侧链上翻译后引入的磷酸泛酰巯基乙胺部分的末端，酰基链转载到硫醇上并不断延伸。在聚酮生物合成装配线上，apo-acp需要通过特定的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶得到磷酸泛酰巯基乙胺支链，转变为末端为硫醇的有活性的holo-acp形式，才能保证装配线的运行。以化学手段合成n-乙酰半胱胺(snac)底物结合体外生化可以作为研究真菌迭代型聚酮合酶(pks)编程规则的一种探针。但是，snac的链长相对于磷酸泛酰巯基乙胺来说太短，可能在模拟pks中间底物时不容易被上载，影响实验结果。因此，也有研究人员直接以泛酰巯基乙胺来模拟acp的硫醇，例如jianting zheng在2012年化学合成了巴豆酰-泛酰巯基乙胺(crotonyl-pantetheine)用于研究spinosyn pks的第二个模块的加工酶spner2及其突变体的活性，在er的作用下，巴豆酰-泛酰巯基乙胺会被催化为丁酰-泛酰巯基乙胺。
2、泛酰巯基乙胺(pantetheine)是泛酸(维生素b5)与半胱胺酰化后的产物，其二聚体pantethine被认为是维生素b5主要的形式。泛酰巯基乙胺同时也是机体合成辅酶a的中间体。泛酰巯基乙胺经泛酸激酶(pank)、磷酸泛酸腺苷酸转移酶(ppat)和去磷酸辅酶a激酶(dpck)生成新型coa衍生物。由于许多聚酮类天然产物以乙酰辅酶a、丙酰辅酶a、丙二酰辅酶a和2-甲基丙二酰辅酶a等为起始单元或者
3、真菌迭代性聚酮合酶(pks)在多次催化聚酮链延伸过程中，同一结构域功能每次可能不同。而现有研究其催化机制的方法主要是通过化学合成snac衍生物去模拟底物，多轮催化延伸过程，则需要花费大量精力合成相应snac底物，费时费力。即使有matb这样的连接酶，也只在活化起始单元时发挥作用，没法直接研究类似kr和dh等结构域的功能。尤其是dh结构域，因为其结构特点，snac底物无法有效被催化。在真菌迭代型pks中，同一结构域在聚酮链延伸过程中的功能可能不一样，kr催化后的羟基构型不一样，dh催化后的双键构型不一样。但在每一轮延伸过程中，都是先在ks结构域作用下先上载一个β酮酸。因此，如果能直接催化酮酸-泛酰巯基乙胺的合成，则可以替代化学合成snac类似物的方式构建pks前体的方式去研究真菌迭代型pks里各结构域的具体催化机制和立体选择性等问题。
4、因此，本领域的技术人员致力于开发一种直接能催化-酮酸与泛酰巯基乙胺的连接酶，能够以泛硫醇为底物催化硫酯形成，同时具有方便、经济、高效的效果。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是开发一种直接能催化-酮酸与泛酰巯基乙胺的连接酶，能够以泛硫醇为底物催化硫酯形成，同时达到具有方便、经济、高效的目的。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种以泛硫醇为底物催化硫酯形成的连接酶，氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术还提供了一种以泛硫醇为底物催化硫酯形成的连接酶在以泛硫醇为底物催化硫酯形成的应用。
4、进一步地，连接酶催化硫酯的反应条件为：反应体系中atp和mg2+的终浓度均为1mm，各底物终浓度均为0.25mm，最后分别加入终浓度为15μm的连接酶，水浴锅中孵育；反应结束后用3倍体积的乙腈淬灭反应。
5、进一步地，该应用包括连接酶催化泛酰巯基乙胺和脂肪酸的合成。
6、进一步地，脂肪酸为2-甲基戊酸、正己酸、异丁酸、2-甲基正丁酸、丁二酸、甲基丙烯酸、(s)-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸、d-α-羟基异戊酸或缬氨酸。
7、进一步地，该应用包括连接酶催化泛酰巯基乙胺类似物和脂肪酸的合成。
8、进一步地，泛酰巯基乙胺类似物为辅酶a或n-乙酰半胱胺。
9、进一步地，该应用包括连接酶催化β酮酸和泛酰巯基乙胺的缩合。
10、进一步地，β酮酸为乙酰乙酸。
11、本专利技术还提供了一种以泛硫醇为底物催化硫酯形成的连接酶的制备方法，步骤为：
12、步骤1、以trichoderma viride的gdna为模板，扩增序列seq id no.1并构建到大肠杆菌和酵母穿梭质粒上，得到目标质粒，并导入酿酒酵母感受态，得到目标菌株；
13、步骤2、将步骤1得到的目标菌株在缺尿嘧啶的培养基筛选培养，接种子液到ypd培养基中放大发酵，得到发酵液；将发酵液经过乙酸乙酯萃取，经减压浓缩后得乙酸乙酯提取物，将乙酸乙酯提取物分离，得到连接酶。
14、在本专利技术的较佳实施方式1中，详细说明了推测的ku42-hrpks-te的催化过程；
15、在本专利技术的另一较佳实施方式2中，详细说明了化合物tv85-coa-ligase-348的分离纯化与结构鉴定过程；
16、在本专利技术的另一较佳实施方式3中，详细说明了tv85-coa-ligase的酶学表征；
17、在本专利技术的另一较佳实施方式4中，详细说明了tv85-coa-ligase以泛酰巯基乙胺和多种脂肪酸为底物,催化硫酯键生成过程；
18、在本专利技术的另一较佳实施方式5中，详细说明了tv85-coa-ligase以泛酰巯基乙胺类似物为底物,催化硫酯键生成过程；
19、在本专利技术的另一较佳实施方式6中，详细说明了tv85-coa-ligase能催化β酮酸和泛酰巯基乙胺的缩合过程。
20、本专利技术有益的技术效果如下：
21、本专利技术公开的连接酶tv85-coa-ligase，能够直接能催化-酮酸与泛酰巯基乙胺的连接酶可以替代化学合成snac类似物的方式构建pks前体的方式去研究真菌迭代型pks里各结构域的具体催化机制和立体选择性等问题，而且tv85-ligase可以催化coa、snac和pantetheine与多种羧酸底物的合成，底物谱范围广，因此能同时达到具有方便、经济、高效的目的。
22、以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种以泛硫醇为底物催化硫酯形成的连接酶，其特征在于，所述连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的连接酶在以泛硫醇为底物催化硫酯形成的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述连接酶催化硫酯的反应条件为：反应体系中ATP和Mg2+的终浓度均为1mM，各底物终浓度均为0.25mM，最后分别加入终浓度为15μM的所述连接酶，水浴锅中孵育；反应结束后用3倍体积的乙腈淬灭反应。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括所述连接酶催化泛酰巯基乙胺和脂肪酸的合成。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脂肪酸为2-甲基戊酸、正己酸、异丁酸、2-甲基正丁酸、丁二酸、甲基丙烯酸、(S)-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸、D-α-羟基异戊酸或缬氨酸。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括所述连接酶催化泛酰巯基乙胺类似物和脂肪酸的合成。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述泛酰巯基乙胺类似物为辅酶A或N-乙酰半胱胺。
8.如权利要
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述β酮酸为乙酰乙酸。
10.如权利要求1所述的连接酶的制备方法，其特征在于，所述方法的步骤为：
...【技术特征摘要】
1.一种以泛硫醇为底物催化硫酯形成的连接酶，其特征在于，所述连接酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述的连接酶在以泛硫醇为底物催化硫酯形成的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述连接酶催化硫酯的反应条件为：反应体系中atp和mg2+的终浓度均为1mm，各底物终浓度均为0.25mm，最后分别加入终浓度为15μm的所述连接酶，水浴锅中孵育；反应结束后用3倍体积的乙腈淬灭反应。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括所述连接酶催化泛酰巯基乙胺和脂肪酸的合成。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脂肪酸为2...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。