【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合、引物组合及其方法和应用。
技术介绍
1、单叶蔷薇( rosa persica)是蔷薇科蔷薇属珍贵种质，主要分布在我国新疆西北地区，具备极佳的观赏性和抗性，是优秀的育种材料和维持生态稳定的重要植物资源。然而，由于其地理分布狭窄，生境特化且易遭到人为破坏，近年来单叶蔷薇数量呈现明显减少的趋势，目前已被列为国家二级保护植物。
2、自然状态下，单叶蔷薇居群数量增长以发达的地下横走结构进行无性繁殖为主，具备克隆植物的特点。早期克隆结构的研究主要通过挖掘地下部分，观察根茎或匍匐茎连接情况来区分单个克隆植物的分布范围，但存在工作量大、破坏性取样等问题。因此，通过分子标记的手段研究克隆植物的遗传多样性及空间遗传结构等方面具有重要意义，可以为单叶蔷薇对环境的适应性策略研究提供科学依据，为顺利开展单叶蔷薇野外居群的保育工作提供保障。
3、目前，国内外关于单叶蔷薇遗传多样性的研究较少，缺乏适用于单叶蔷薇遗传分析的ssr特异引物。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于，提供一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合、引物组合及其方法和应用，所要解决的技术问题是如何提出适用于单叶蔷薇遗传分析的ssr特异引物组合，其多态性较高且稳定性较好，从而更加适于实用。
2、本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本专利技
3、本专利技术的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本专利技术提出的一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合的引物组合，前述的引物组合包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8，前述的引物对1~8的核苷酸序列分别如seq id no.1~16所示。
4、本专利技术的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本专利技术提出的一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其步骤包括：
5、(1)采集单叶蔷薇居群的叶片，提取dna，以单叶蔷薇基因组dna为模板，利用前述的ssr标记组合的引物组合进行pcr扩增，得到扩增产物；
6、(2)前述的扩增产物进行电泳，根据ssr位点扩增片段峰值图，获得基因型数据；
7、(3)利用步骤(2)中前述的基因型数据进行基因分型和克隆鉴别，进而评估单叶蔷薇居群遗传多样性和克隆结构。
8、本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
9、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，步骤(1)中，pcr扩增反应体系为10 μl，包括：1μl 浓度为25 ng/μl 的dna模板、0.3 μl 浓度为10 μmol/l的m13f上游引物序列结合的荧光标记物、0.1 μl浓度为10 μmol/l的上游引物、0.2 μl浓度为10 μmol/l的下游引物、5 μl 的2×浓度的pcr扩增预混液和3.4 μl超纯水。
10、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，前述的m13f上游引物序列结合的荧光标记物中，引物对1、引物对2、引物对5、引物对6和引物对8的荧光标记物为fam，引物对3的荧光标记物为rox，引物对7的荧光标记物为hex，引物对4的荧光标记物为tamra。
11、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，在步骤(3)中，包括采用软件genemapper v4.1读取每个位点扩增片段峰值图，使用ssr数据处理宏程序datatrans_1.0将前述的基因型数据转化为0/1矩阵；采用popgene 32软件计算遗传多样性参数；采用popgene 32软件基于nei's遗传距离进行upgma聚类分析；基于genalex 6.5软件进行amova分析。
12、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，在步骤(3)中，包括运用观测等位基因数、有效等位基因数、nei's基因多样性指数和shannon指数的参数分析遗传多样性。
13、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，在步骤(3)中，包括应用ntsys软件计算j&c遗传距离进行克隆鉴别；计算5个居群的克隆参数，包括克隆面积、克隆的最大长宽比率、各居群的克隆数及分株间的距离。
14、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，在步骤(3)中，包括运用genalex 6.5软件计算单叶蔷薇所有分株遗传距离矩阵在相应距离等级下的空间自相关系数，分析其克隆结构。
15、在一些实施例中，根据前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，在步骤(3)中，包括运用基株数目、不同基因型比例、基因型比率、simpson多样性指数以及fager指数指标分析克隆多样性；运用genalex 6.5进行pcoa主坐标分析。
16、本专利技术的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。本专利技术提出前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合、评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合的引物组合或任一项前述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法在单叶蔷薇克隆居群遗传结构和遗传多样性分析、生态适应性机制研究、遗传背景分析筛选或分子标记辅助育种中的应用。
17、借由上述技术方案，本专利技术一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合、引物组合及其方法和应用至少具有下列优点：
18、本专利技术提出的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合及其引物组合多态性高且稳定性好，可用于单叶蔷薇居群的遗传结构和克隆多样性研究，为单叶蔷薇生态适应性机制研究提供依据；还可用于单叶蔷薇遗传背景分析和筛选，以及分子标记辅助育种，为单叶蔷薇物种的鉴定、保护和保育提供技术支撑。
19、上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
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1.一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的SSR标记组合，其特征在于，所述SSR标记组合包括RP-13、RP-41、RP-42、RP-43、RP-44、RP-47、RP-61和RP-131。
2.一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的SSR标记组合的引物组合，所述引物组合包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8，所述引物对1~8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~16所示。
3.一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于：步骤(1)中，PCR扩增反应体系为10 μL，包括：1μL 浓度为25 ng/μL 的DNA模板、0.3 μL 浓度为10 μmol/L的M13F上游引物序列结合的荧光标记物、0.1 μL浓度为10 μmol/L的上游引物、0.2 μL浓度为10 μmol/L的下游引物、5 μL 的2×浓度的PCR扩增预混液和3.4 μL超纯水。
5.根据权利要求4所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，所
6.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，在步骤(3)中，包括采用软件GeneMapper v4.1读取每个位点扩增片段峰值图，使用SSR数据处理宏程序DataTrans_1.0将所述基因型数据转化为0/1矩阵；采用Popgene 32软件计算遗传多样性参数；采用Popgene 32软件基于Nei's遗传距离进行UPGMA聚类分析；基于GenAlEx 6.5软件进行AMOVA分析。
7.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，在步骤(3)中，遗传多样性参数包括观测等位基因数、有效等位基因数、Nei's基因多样性指数和Shannon指数。
8.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，在步骤(3)中，应用NTSYS软件计算J&C遗传距离进行克隆鉴别；计算5个居群的克隆参数，包括克隆面积、克隆的最大长宽比率、各居群的克隆数及分株间的距离。
9.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，在步骤(3)中，运用GenAlEx 6.5软件计算单叶蔷薇所有分株遗传距离矩阵在相应距离等级下的空间自相关系数，分析其克隆结构。
10.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，在步骤(3)中，运用指标分析克隆多样性，包括基株数目、不同基因型比例、基因型比率、Simpson多样性指数以及Fager指数；运用GenAlEx 6.5进行PCoA主坐标分析。
11.权利要求1所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的SSR标记组合、权利要求2所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的SSR标记组合的引物组合或权利要求3~10任一项所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法在单叶蔷薇克隆居群遗传结构和遗传多样性分析、生态适应性机制研究、遗传背景分析筛选或分子标记辅助育种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合，其特征在于，所述ssr标记组合包括rp-13、rp-41、rp-42、rp-43、rp-44、rp-47、rp-61和rp-131。
2.一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的ssr标记组合的引物组合，所述引物组合包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7和引物对8，所述引物对1~8的核苷酸序列分别如seq id no.1~16所示。
3.一种评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于：步骤(1)中，pcr扩增反应体系为10 μl，包括：1μl 浓度为25 ng/μl 的dna模板、0.3 μl 浓度为10 μmol/l的m13f上游引物序列结合的荧光标记物、0.1 μl浓度为10 μmol/l的上游引物、0.2 μl浓度为10 μmol/l的下游引物、5 μl 的2×浓度的pcr扩增预混液和3.4 μl超纯水。
5.根据权利要求4所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，所述m13f上游引物序列结合的荧光标记物中，引物对1、引物对2、引物对5、引物对6和引物对8的荧光标记物为fam，引物对3的荧光标记物为rox，引物对7的荧光标记物为hex，引物对4的荧光标记物为tamra。
6.根据权利要求3所述的评估单叶蔷薇居群遗传多样性的方法，其特征在于，在步骤(3)中，包括采用软件genemapper v4.1读取每个位点扩增片段峰值图，使用ssr数据处理宏程序datatrans_1.0将所述基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗乐，张晨洁，于超，张雪云，刘学森，张晓龙，张启翔，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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