【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农药检测，具体涉及一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法。
技术介绍
1、农药是继化肥后第二大类人工合成的农用化学品。大量农药进入到空气、水体、土壤中，污染农畜渔果产品，并通过食物链转移到人体内，产生急性或慢性危害。据估计每年有数百万人因农药中毒，其中约30万人因农药中毒死亡。农药的传统检测方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱、毛细管电泳和质谱等，这些都是非常有效和相当准确的方法，被认为是农药检测的金标准。然而它们的缺点也很明显，比如前处理过程复杂、操作繁琐、仪器昂贵、需要专业操作人员等，无法满足目前农业生产需要的快速、高通量、实时、低成本等检测需求。
2、生物传感方法具有简单、快速、高效等特点，已经应用于农药残留的快速检测，比如基于酶抑制或免疫反应的农药检测。有机磷类或氨基甲酸酯类农药中的磷元素与乙酰胆碱酯酶的活性位点结合可致其失活，因此可根据该酶活性抑制情况检测农药含量，然而该类生物传感器不能区分农药种类，且容易受重金属和其他类型农药的影响。免疫传感器依赖于农药抗原与其抗体的特异性结合，也是目前常用的农药残留快速检测方法。不过，由于农药分子体积小，可获得的农药抗体少，且抗体制备复杂，成本高。基于抗原-抗体反应的传感方法同时检测多种农药仍旧是个挑战。因此开发高灵敏、快速检测农药新方法具有重要意义。
3、核酸适配体是通过指数富集系统进化技术获得的寡核酸序列，具有识别度和亲和力高、分子量小、易修饰、良好稳定性和低成本等优点，被广泛应用于生物传感领域。适配体可以将自身
4、纳米孔传感器以实时、高灵敏度、高特异性、无需标记等特点广泛应用于生物医学、纳米化学、生物物理学等学科领域。该类传感器的原理是目标物穿过纳米孔过程中与孔内基团相互作用，导致离子电流发生变化，从而反映出目标物的大小、浓度、结构等信息。目标物的大小与纳米孔内径尺寸越接近，其离子电流信号波动越明显。
技术实现思路
1、因此，本专利技术提供一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法。
2、本专利技术的技术方案是：一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，首先将待测农药与其对应的核酸适配体结合，得到农药-适配体复合物，然后利用α-溶血素纳米孔传感器对所述农药-适配体复合物与其对应的核酸适配体进行检测，获得二者各自的电流阻断信号，根据二者的电流阻断信号的差异，检测出待测农药。
3、说明：上述进行农药检测的方法具有高灵敏、高特异性，基于农药-适体复合物通过α-溶血素纳米孔产生的电流阻断信号与单独的适配体产生的电流阻断信号不同，能够快速测出有机磷农药。
4、进一步地，所述待测农药为辛硫磷和/或氧化乐果。
5、说明：由于辛硫磷-适配体复合物和氧化乐果-适配体复合物的电流阻断程度明显不同，因此能够同时定量检测出辛硫磷和氧化乐果两种农药。
6、进一步地，辛硫磷对应的核酸适配体的序列如seq id number 1所示，氧化乐果对应的核酸适配体的序列如seq id number 2所示。
7、说明：上述核酸适配体能够与对应待测农药进行特异性结合，根据二者穿过α-溶血素纳米孔传感器时阻断程度的差异，对这两种农药进行检测和区分。
8、进一步地，所述电流阻断信号的差异包括电流阻断程度和阻断时间；所述电流阻断程度是待测物停留在α-溶血素纳米孔内时产生的堵塞电流与无待测物穿孔时的开孔电流的比值；检测时，辛硫磷-适配体复合物的特征阻断程度比辛硫磷适配体的大；而氧化乐果-适配体复合物的阻断程度比氧化乐果适配体的小。
9、说明：上述辛硫磷-适配体复合物的阻断程度与氧化乐果-适配体复合物的不同，能够利用α-溶血素纳米孔传感器对辛硫磷与氧化乐果两种农药进行区分。
10、进一步地，所述α-溶血素纳米孔传感器包括：用分子层分隔的反式室与顺式室、位于顺式室与反式室内的缓冲液以及ag电极，所述分子层为含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层；所述缓冲液由1mkcl、1mm edta、25mm hepes组成，缓冲液ph为7.5。
11、说明：上述为α-溶血素纳米孔传感器的框架设置，以方便进行检测。
12、进一步地，所述含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层的形成方法为：首先在delrin双层杯中跨越50微米孔口形成脂质膜，将两个ag电极分别浸入反式室与顺式室的缓冲液中，至电流处于溢出状态，并在顺式室一侧的脂质膜上刷一层磷脂层，以形成脂质双分子层；静置10分钟后，在顺式室的孔侧加入金黄色葡萄球菌α-溶血素，形成含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层。
13、说明：上述方法为防止脂质双分子层中α-溶血素形成多个孔，在形成α-溶血素纳米孔后立即降低电压以形成稳定的单孔结构。并在施加正电压的条件下，向顺式室附近添加目标分析物，使带负电荷的单链dna过孔，产生电流阻断信号。
14、进一步地，检测步骤为：在室温下，将辛硫磷、辛硫磷适配体、氧化乐果以及氧化乐果适配体孵育2～3小时，得到农药-适配体复合物的混合体系，然后将混合体系加入顺式室中，在反式室的电极侧施加120mv的电压，顺式室的电极侧电压接地；出现多个电流阻断信号，根据电流阻断信号的差异，区分辛硫磷-适配体复合物、氧化乐果-适配体复合物、辛硫磷适配体和氧化乐果适配体。
15、说明：上述为具体的操作方法，以对辛硫磷、氧化乐果进行检测与区分。
16、进一步地，检测前，先通过下述步骤判断电流阻断程度识别农药-适配体复合物方法的可行性：首先在设定电压下，分别观察待测农药、核酸适配体及农药-适配体复合物的阻断电流，若发现待测农药未出现电流阻断信号，核酸适配体和农药-适配体复合物出现了电流阻断信号，且农药-适配体复合物的电流阻断程度大于或小于核酸适配体的电流阻断程度；则认为根据电流阻断信号的差异识别农药-适配体复合物的方法是可行的；否则认为根据电流阻断信号的差异识别农药-适配体复合物的方法不可行。
17、说明：上述方式可以通过分析农药-适配体复合物的阻断程度定量检测农药。
18、进一步地，当同时检测多种农药时，首先对比多种农药-适配体复合物的电流阻断信号是否存在区分，且其中待测农药与其对应的适配体的结合具有专一性；若存在区分且具有专一性，则说明可以同时进行多种农药的检测；否则说明不可以同时进行多种农药的检测。
19、说明：上述方法可以同时对多种农药的混合体系进行检测，增强农药检测的实用性。
20、进一步地，判断待测农药与其对应的适配体的结合具有专一性的方法为：
21、首先选用氧化乐果适配体与辛硫磷和氧化乐果共同孵育；增加辛硫磷和氧化乐果农药浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，首先将待测农药与其对应的核酸适配体结合，得到农药-适配体复合物，然后利用α-溶血素纳米孔传感器对所述农药-适配体复合物与其对应的核酸适配体进行检测，获得二者各自的电流阻断信号，根据二者的电流阻断信号的差异，检测出待测农药。
2.如权利要求1所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述待测农药为辛硫磷和/或氧化乐果。
3.如权利要求2所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，辛硫磷对应的核酸适配体的序列如SEQ ID Number 1所示，氧化乐果对应的核酸适配体的序列如SEQ ID Number 2所示。
4.如权利要求2所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述电流阻断信号的差异包括电流阻断程度和阻断时间；所述电流阻断程度是待测物停留在α-溶血素纳米孔内时产生的堵塞电流与无待测物穿孔时的开孔电流的比值；检测时，辛硫磷-适配体复合物的特征阻断程度比辛硫磷适配体的大；而氧化乐果-适配体复合物
5.如权利要求4所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述α-溶血素纳米孔传感器包括：用分子层分隔的反式室与顺式室、位于顺式室与反式室内的缓冲液以及Ag电极，所述分子层为含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层；所述缓冲液由1MKCl、1mM EDTA、25mM HEPES组成，缓冲液pH为7.5。
6.如权利要求5所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层的形成方法为：首先在Delrin双层杯中跨越50微米孔口形成脂质膜，将两个Ag电极分别浸入反式室与顺式室的缓冲液中，至电流处于溢出状态，并在顺式室一侧的脂质膜上刷一层磷脂层，以形成脂质双分子层；静置10分钟后，在顺式室的孔侧加入金黄色葡萄球菌α-溶血素，形成含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层。
7.如权利要求5所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，检测步骤为：在室温下，将辛硫磷、辛硫磷适配体、氧化乐果以及氧化乐果适配体孵育2～3小时，得到农药-适配体复合物的混合体系，然后将混合体系加入顺式室中，在反式室的电极侧施加120mV的电压，顺式室的电极侧电压接地；出现多个电流阻断信号，根据电流阻断信号的差异，区分辛硫磷-适配体复合物、氧化乐果-适配体复合物、辛硫磷适配体和氧化乐果适配体。
8.如权利要求7所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，检测前，先通过下述步骤判断通过电流阻断程度识别农药-适配体复合物方法的可行性：当待测农药进行单独检测时，首先在设定电压下，分别观察待测农药、核酸适配体及农药-适配体复合物的阻断电流，若发现待测农药未出现电流阻断信号，核酸适配体和农药-适配体复合物出现了电流阻断信号，且农药-适配体复合物的电流阻断程度大于或小于核酸适配体的电流阻断程度；则认为根据电流阻断信号的差异识别农药-适配体复合物的方法是可行的；否则认为根据电流阻断信号的差异识别农药-适配体复合物的方法不可行。
9.如权利要求8所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，当同时检测多种农药时，首先对比多种农药-适配体复合物的电流阻断信号是否存在区分，且其中待测农药与其对应的适配体的结合具有专一性；若存在区分且具有专一性，则说明可以同时进行多种农药的检测；否则说明不可以同时进行多种农药的检测。
...【技术特征摘要】
1.一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，首先将待测农药与其对应的核酸适配体结合，得到农药-适配体复合物，然后利用α-溶血素纳米孔传感器对所述农药-适配体复合物与其对应的核酸适配体进行检测，获得二者各自的电流阻断信号，根据二者的电流阻断信号的差异，检测出待测农药。
2.如权利要求1所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述待测农药为辛硫磷和/或氧化乐果。
3.如权利要求2所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，辛硫磷对应的核酸适配体的序列如seq id number 1所示，氧化乐果对应的核酸适配体的序列如seq id number 2所示。
4.如权利要求2所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述电流阻断信号的差异包括电流阻断程度和阻断时间；所述电流阻断程度是待测物停留在α-溶血素纳米孔内时产生的堵塞电流与无待测物穿孔时的开孔电流的比值；检测时，辛硫磷-适配体复合物的特征阻断程度比辛硫磷适配体的大；而氧化乐果-适配体复合物的阻断程度比氧化乐果适配体的小。
5.如权利要求4所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述α-溶血素纳米孔传感器包括：用分子层分隔的反式室与顺式室、位于顺式室与反式室内的缓冲液以及ag电极，所述分子层为含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层；所述缓冲液由1mkcl、1mm edta、25mm hepes组成，缓冲液ph为7.5。
6.如权利要求5所述的一种基于α-溶血素纳米孔传感器的有机磷农药检测方法，其特征在于，所述含α-溶血素生物纳米孔的脂质双分子层的形成方法为：首先在delrin双层杯中跨越50微米孔口形成...
【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，李彬，王鑫如，刘翔宇，李广阅，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：
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