【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学检测，尤其涉及一种荧光探针检测机体组织或血液dna中gucy2ccar拷贝数的检测方法。
技术介绍
1、car一般有一个scfv单链抗体(抗体轻重链可变区通过一个l inker多肽链接构成，负责结合抗原)，通过铰链结构与跨膜区、胞内信号结构连接而成，其中胞内信号结构域负责向胞内传递t细胞激活和活化信号。经car基因改造的t细胞可以识别肿瘤细胞膜上特定的抗原分子，启动t细胞的杀伤、增殖以及细胞因子分泌能力。
2、鸟苷酸环化酶c(guany ly l cyc l ase c,gucy2c)是属于受体鸟苷酸环化酶家族的一种跨膜蛋白，被大肠杆菌热稳定肠毒素(sta)、鸟苷素和尿鸟苷素激活后，将胞外信息传送至胞内，参与调节肠道功能。gucy2c表达于原发性结直肠癌细胞中，在转移性结直肠癌细胞中gucy2c的表达是正常肠上皮细胞的2-10倍，另外在有结肠癌转移的淋巴结和肝脏组织中也均有表达。此外，gucy2c在胰腺癌、胃癌和食道癌中(占比达到60％)也有表达，以上信息表明gucy2c可以作为这些疾病的靶标。实际上，这类癌症的治疗一般是以全身抗肿瘤药物治疗为主的综合治疗，比较依赖于充分的循证医学证据以及丰富的临床实践经验，随着癌症分子机制研究的不断深入，各类癌症的的分子靶向治疗逐渐崭露头角。
3、其中嵌合抗原受体t细胞(car-t)治疗快速问世，迅速成为治疗恶性肿瘤的有效方法，尤其临床结果表明car-t细胞在治疗血液系统恶性肿瘤具有极大的优势比如car-t目前在部分白血病和淋巴瘤的治疗中效果非常
技术实现思路
1、基于上述问题，本专利技术所要解决的问题在于提供一种检测周期短、灵敏度高、成本低的荧光探针检测机体组织或血液dna中gucy2c car拷贝数的检测方法。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种荧光探针检测机体组织或血液dna中gucy2c car拷贝数的检测方法，包括如下步骤：
4、获取机体组织或血液dna样本；
5、将扩增体系与机体组织或血液dna样本混合，进行等温扩增反应，获得扩增产物；
6、在等温扩增反应过程中，用荧光探针对扩增产物进行实时检测，以判断是否有荧光信号放大，如是，则表明存在gucy2c car拷贝；
7、其中，所述扩增体系中的组分包括：5～30μl pcr反应液、0.5～2μl荧光探针和0.5～2μlgucy2c car拷贝特异性引物。
8、所述检测方法中，所述机体组织或血液dna样本的体积为1～10μl、浓度为100～500ng/μl。
9、所述检测方法中，所述等温扩增反应中，反应温度为58℃～95℃、反应时间为90min～95min。
10、所述检测方法中，所述等温扩增反应中，还包括如下反应步骤及反应条件：
11、预变性：95℃，10min；
12、变性：95℃，15s；
13、复制：58℃、60℃、62℃或64℃，1min；
14、其中，变性步骤和复制步骤，交替执行此40个循环。
15、所述检测方法中，所述gucy2c car拷贝特异性引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物为gucy2c-scfv-01-f，所述反向引物为gucy2c-scfv-01-r；其中，所述gucy2c-scfv-01-f的核酸序列为：5’-gatgcactgggctagacaag-3’；所述gucy2c-scfv-01-r的核酸序列为：5’-atgtaggcggtgttggtg-3’。
16、所述检测方法中，所述荧光探针为gucy2c scfv-01-probe；其中，所述gucy2cscfv-01-probe的核酸序列为：5’-tggctctgtccttgaacttctcgttg-3’。
17、所述检测方法中，所述荧光检测探针为茎环结构且5’端标记荧光基团及3’端标记淬灭基团。
18、所述检测方法中，所述茎环结构中间添加有第二种淬灭基团。
19、本专利技术提供的检测机体组织或血液中gucy2c car拷贝数的检测方法，采用扩增体系与机体组织或血液dan样本混合，进行两步扩增循环；在扩增过程中，用荧光探针对扩增产物进行实时检测，通过探针荧光强度定量gucy2c car拷贝数，其最低检测浓度可到达10拷贝/μl，并能成功检测机体组织或血液中gucy2c car拷贝数目。
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1.一种荧光探针检测机体组织或血液DNA中GUCY2C CAR拷贝数的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述机体组织或血液DNA样本的体积为1～10μl、浓度为100～500ng/μl。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应中，反应温度为58℃～95℃、反应时间为90min～95min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应中，还包括如下反应步骤及反应条件：
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述GUCY2C CAR拷贝特异性引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物为GUCY2C-scFv-01-F，所述反向引物为GUCY2C-scFv-01-R。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述GUCY2C-scFv-01-F的核酸序列为：5’-GATGCACTGGGCTAGACAAG-3’；所述GUCY2C-scFv-01-R的核酸序列为：5’-ATGTAGGCGGTGTTGGTG-3’。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述GUCY2C scFv-01-probe的核酸序列为：5’-TGGCTCTGTCCTTGAACTTCTCGTTG-3’。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光检测探针为茎环结构且5’端标记荧光基团及3’端标记淬灭基团。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述茎环结构中间添加有第二种淬灭基团。
...【技术特征摘要】
1.一种荧光探针检测机体组织或血液dna中gucy2c car拷贝数的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述机体组织或血液dna样本的体积为1～10μl、浓度为100～500ng/μl。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应中，反应温度为58℃～95℃、反应时间为90min～95min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应中，还包括如下反应步骤及反应条件：
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述gucy2c car拷贝特异性引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物为gucy2c-scfv-01-f，所述反向引物为gucy2c-scfv-01-r。
6.根据权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：马丽雅，王鉴，刘东，
申请(专利权)人：深圳市先康达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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