【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物保护，涉及一种在麦田恶性杂草猪殃殃上快速过量表达基因的方法，用于研究猪殃殃基因在抗除草剂过程中的作用。
技术介绍
1、农田杂草严重危害农作物的生产，与作物竞争营养和光照等、且传播植物病虫害，最终导致粮食减产甚至绝收。小麦在世界各地广泛种植，是世界上最重要的粮食作物之一，世界上约有40％的人口以小麦为主要粮食。小麦田杂草发生严重，且杂草种类多样；目前，在农业生产上，主要依赖于除草剂的施用以控制杂草危害。猪殃殃属于茜草科植物，是麦田中的一种重要阔叶杂草，与小麦竞争营养与光照等，并可引致小麦倒伏，造成作物减产。农业生产过程中主要通过施用苯磺隆和氯氟吡氧乙酸等除草剂以控制其危害，田间杂草发生情况调查发现猪殃殃在一些小麦主产区发生逐年加重。多个研究组通过从田间采集残存猪殃殃种子，进行室内生物测定，发现50％～90％猪殃殃种群已对苯磺隆产生了抗药性，严重影响其田间防除效果。
2、猪殃殃对苯磺隆的抗药性主要分为靶标抗性和非靶标抗性。靶标抗性主要表现在苯磺隆靶标酶—乙酰乳酸合酶的突变与表达量升高等。非靶标抗性主要表现为代谢抗性和吸收转运减弱等。随着高通量测序技术的发展，猪殃殃中大量与抗药性相关的基因被鉴定到，但是这些基因是如何参与抗药性的功能机制尚不清楚。为了更好的开发抗性猪殃殃的田间治理技术，亟需研究猪殃殃抗药性相关基因的作用机理。对于猪殃殃抗药性基因功能的研究，目前主要将猪殃殃基因通过转基因技术转到拟南芥、水稻或酵母等中进行功能研究，存在实验周期长，异源表达基因功能准确性下降等缺点。
3、本专利技术
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用植物病毒生物技术在猪殃殃上快速过量表达基因的方法。
2、本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：
3、第一方面，本专利技术的请求保护一种在猪殃殃上快速过量表达基因的方法，该方法为将目的基因插入到烟草花叶病毒载体tmv-gfp中构建重组病毒载体，将重组病毒载体转化导入农杆菌，利用农杆菌菌液浸润植物幼苗制备重组病毒；在猪殃殃上摩擦接种重组病毒，实现目的基因在猪殃殃上的快速过量表达，成功建立猪殃殃基因表达系统。
4、本专利技术的具体实施例中，所述的目的基因为bar基因，但不限于此。
5、进一步，所述的bar基因插入到烟草花叶病毒载体中构建重组病毒载体的过程为：采用引物f1和r1，以ptf101.1质粒为模板进行pcr扩增得到bar基因，将pcr扩增产物和tmv-gfp质粒分别用paci&pspxi酶切后进行连接构建了tmv-bar重组病毒载体；
6、f1：tcattaattaaatgagcccagaacgacgcc；
7、r1：acccctcgagttaagcgtaatctggaacatcgtatgggtagatctcggtgac gggcagg。
8、第二方面，本专利技术的请求保护bar基因在调控猪殃殃对除草剂抗性中的应用。
9、进一步，上述的应用为在猪殃殃中过表达bar基因的能够提高猪殃殃对除草剂(草铵膦)抗性。在猪殃殃中过表达bar基因的过程为：采用引物f1和r1(如上所述)，以ptf101.1质粒为模板进行pcr扩增得到bar基因，将pcr扩增产物和tmv-gfp质粒分别用paci&pspxi酶切后进行连接构建了tmv-bar重组病毒载体；将重组病毒载体转化导入农杆菌，利用农杆菌菌液浸润植物幼苗制备重组病毒；在猪殃殃上摩擦接种重组病毒，实现bar基因在猪殃殃上的快速过量表达，提高猪殃殃对除草剂(草铵膦)抗性。
10、本专利技术借助于烟草花叶病毒载体tmv-gfp质粒，将基因插入到病毒载体，在猪殃殃上摩擦接种重组病毒，实现基因在猪殃殃上的表达，成功建立猪殃殃基因表达系统。
11、本专利技术的创新点：猪殃殃作为一种小麦田杂草，其对除草剂的抗药性发展迅速，导致防除失败，杂草猖獗，小麦产量下降。研究人员一直在深入研究猪殃殃的抗药性机制，以期望找到新的抗性杂草控制方法。目前的杂草抗药性相关基因的功能研究主要通过异源表达系统进行功能验证，准确性不高。本专利技术建立了直接在猪殃殃上研究猪殃殃抗药性基因功能的新体系，时间短，准确性高。本专利技术方法用于研究杂草的抗药性机制。该方法对杂草抗药性研究是全新的方法与思路。
12、本专利技术的有益效果：
13、(1)实验周期短，2-3月时间即可完成猪殃殃抗药性基因功能解析。之前的传统转基因方法至少需要8个月。
14、(2)实验结论准确性高。该方法可以直接在猪殃殃上研究其基因功能，其它转基因方法是异源表达系统，影响猪殃殃抗药性基因功能的精确解析。
15、(3)实验过程操作简便。实验过程需要通过分子生物学手段构建病毒载体，农杆菌浸润与重组病毒汁液摩擦接种，这些实验方法简便，且极易熟练掌握。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种在猪殃殃上快速过量表达基因的方法，其特征在于，该方法为将目的基因插入到烟草花叶病毒载体中构建重组病毒载体，将重组病毒载体转化导入农杆菌，利用农杆菌菌液浸润植物幼苗制备重组病毒；在猪殃殃上摩擦接种重组病毒，实现目的基因在猪殃殃上的快速过量表达，成功建立猪殃殃基因表达系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目的基因为BAR基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的BAR基因插入到烟草花叶病毒载体中构建重组病毒载体的过程为：采用引物F1和R1，以pTF101.1质粒为模板进行PCR扩增得到BAR基因，将PCR扩增产物和TMV-GFP质粒分别用PacI&PspXI酶切后进行连接构建了TMV-BAR重组病毒载体；
4.BAR基因在调控猪殃殃对除草剂草铵膦抗性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在猪殃殃中过表达BAR基因的能够提高猪殃殃对除草剂草铵膦抗性。
【技术特征摘要】
1.一种在猪殃殃上快速过量表达基因的方法，其特征在于，该方法为将目的基因插入到烟草花叶病毒载体中构建重组病毒载体，将重组病毒载体转化导入农杆菌，利用农杆菌菌液浸润植物幼苗制备重组病毒；在猪殃殃上摩擦接种重组病毒，实现目的基因在猪殃殃上的快速过量表达，成功建立猪殃殃基因表达系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目的基因为bar基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的bar基...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯致科，刘颖，董立尧，陶小荣，任艳蓉，马友梅，冯明峰，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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