【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种杆状病毒表达载体及其构建方法、应用。
技术介绍
1、杆状病毒是特异感染节肢动物的双联dna病毒，以杆状病毒表达载体系统(bculovrius expression vector system，bevs)为基础建立的杆状病毒可以在昆虫细胞中表达多种蛋白，如猪圆环cap蛋白、鸡传染性法氏囊vp2蛋白、猪瘟e2蛋白等，并以其低成本、相对完善的翻译后修饰系统等优点，在科研和生产中广泛使用，尤其是生物制品和疫苗行业。
2、hr1增强子是富含at重复或者回文结构的同源区域，此区域经常会出现ecori酶切位点，为杆状病毒启动子添加增强子可以大大提高蛋白产量。ie1基因大小67kd，可以和dna结合，刺激转录，ie1是一个具有光谱性，非特异性的转录激活因子。
3、由于杆状病毒表达系统外源蛋白表达量提高，可以降低生产和纯化成本。因此利用特定的技术手段进一步提高杆状病毒表达系统对外源蛋白的表达量具有极其重要的意义。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的问题，本专利技术专利设计了一种杆状病毒表达载体，通过改造杆状病毒表达载体，添加增强子序列进一步提高病毒外源蛋白的表达量。
2、本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种杆状病毒表达载体，所述杆状病毒表达载体包括pfastbac dual载体骨架，所述pfastbac dual载体骨架通过融合pcr连接一段e1-hr1基因序列，所述pfastbac dual载体骨架的核苷酸序列如
4、进一步的，所述e1-hr1基因序列包括ie1基因、gp64 p启动子、hr1基因序列、第二启动子以及多克隆mcs位点。
5、进一步的，所述第二启动子为p10启动子、ph启动子、cmv启动子或gp64 p启动子中的任何一种。
6、进一步的，所述第二启动子为p10启动子。
7、本专利技术提供的上述杆状病毒表达载体的构建方法的具体步骤为：
8、(1)人工合成一段e1-hr1基因序列，该序列包含ie1基因、gp64 p启动子、hr1基因和p10启动子，如seq id no.1所示，将合成的e1-hr1序列连接到puc57载体上，形成puc57-e1-hr1；
9、(2)设计引物1和引物2，所述引物1和引物2均含有pfastbac dual序列上的同源臂，所述引物1的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述引物2的核苷酸序列如seq id no.6所示；以puc57-e1-hr1为模板扩增e1-hr1序列，设计引物3和引物4，所述引物3和引物4均含有e1-hr1序列上的同源臂，所述引物3的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述引物4的核苷酸序列如seq id no.8所示；
10、(3)以pfastbac dual载体为模板，扩增载体pfastbac dual载体骨架序列，如seqid no.4所示，将上述扩增的序列进行融合，通过转染dh5a感受态细胞、挑单克隆、提质粒等的分子克隆手段，获得杆状病毒表达载体，并命名为pfastbac-ie1-hr1。
11、本专利技术提供的上述杆状病毒表达载体能够应用在病毒外源蛋白的表达中，所述病毒外源蛋白包括猪圆环cap2d蛋白、鸡传染性法氏囊vp2蛋白等多种病毒蛋白。
12、本专利技术提供的上述杆状病毒表达载体应用于病毒外源蛋白表达的方法的具体步骤为：
13、(1)将病毒外源蛋白的基因序列连接到杆状病毒表达载体的多克隆位点，构建带有病毒外源蛋白基因的表达载体，使用该表达载体转化dh10bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选以及pcr鉴定获得含有病毒外源蛋白基因的重组杆粒；
14、(2)使用获得的重组杆粒转染sf9细胞，收毒，获得能够高效表达相应病毒外源蛋白的重组杆状病毒；
15、(3)将上述获得的重组杆状病毒在昆虫细胞h5中进行高效表达，离心收获上清液。
16、相对于现有技术，本专利技术专利设计的一种杆状病毒表达载体的进步之处在于：本专利技术提供的杆状病毒表达载体由pfastbac dual载体骨架通过融合pcr连接一段e1-hr1基因序列，e1-hr1基因序列中包含完整的ie1基因序列，而非传统的只使用ie1启动子片段，并以二聚体形式与hr1序列结合，能够显著增强dna的转录，提高目标蛋白的表达量。以猪圆环病毒cap2d蛋白和鸡传染性法氏囊vp2蛋白为例，通过本专利技术专利提供的杆状病毒表达载体转化后的细胞，对cap2d蛋白和vp2蛋白的表达量分别提高了5.0和4.8倍，提升效果显著，可以大幅降低对相关病毒蛋白的生产和纯化成本。
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1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述杆状病毒表达载体包括pFastbac dual载体骨架，所述pFastbac dual载体骨架通过融合PCR连接一段E1-hr1基因序列，所述pFastbac dual载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述E1-hr1基因的序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述E1-hr1基因序列包括IE1基因、GP64 P启动子、hr1基因序列、第二启动子以及多克隆MCS位点。
3.根据权利要求2所述的一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述第二启动子为P10启动子、PH启动子、CMV启动子或GP64 P启动子中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述第二启动子为P10启动子。
5.一种如权利要求4所述的杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法的具体步骤为：
6.一种如权利要求4所述的杆状病毒表达载体在病毒外源蛋白表达中的应用。
7.根据权利要求6所述的杆状病毒表达载
8.一种如权利要求4所述的杆状病毒表达载体应用于病毒外源蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
...【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述杆状病毒表达载体包括pfastbac dual载体骨架，所述pfastbac dual载体骨架通过融合pcr连接一段e1-hr1基因序列，所述pfastbac dual载体骨架的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述e1-hr1基因的序列如seqid no.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述e1-hr1基因序列包括ie1基因、gp64 p启动子、hr1基因序列、第二启动子以及多克隆mcs位点。
3.根据权利要求2所述的一种杆状病毒表达载体，其特征在于，所述第二启动子为p10启动子、ph启动子、cmv...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜凤，曹玉飞，周佳彬，韩睿，张乾顺，马宁宁，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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