【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术、生物多样性保护领域，具体地说，涉及一种用于大熊猫个体识别的微单倍型遗传标记分型体系及其应用。
技术介绍
1、大熊猫(ailuropoda melanoleuca)是我国濒危珍稀野生动物之一，是世界生物多样性保护的旗舰物种。目前，野外大熊猫种群数量已增长到1900余只，全球圈养大熊猫数量已达600多只，物种受威胁程度已从濒危降为易危。野外种群分布广泛，但总体呈孤岛状、碎片化，推进大熊猫种群间栖息地连接成片能有效促进种群间基因交流。野化放归与引种既是增加圈养大熊猫遗传多样性的重要手段，也是推进野外种群复壮的重要措施。大熊猫个体识别是开展大熊猫保护研究工作的基础，咬节法是最早在大熊猫种群普查项目中被采用的方法。咬节法是通过大熊猫粪便中残余的竹节长度、齿宽、形状等特征判断大熊猫个体。随着遗传标记及测序技术的发展，现多采用dna遗传标记来提升大熊猫个体识别的准确性。另外，红外相机技术结合基于机器学习的猫脸识别技术也在实践中得到广泛应用。
2、过去二十年来，用于大熊猫个体识别遗传标记主要采用微卫星(也称短串联重复序列，short tandem repeat,str)标记。str标记由多个串联重复的核心序列(coresequence或motif)组成，核心序列长1-6bp，重复次数呈现多态性，pcr扩增容易产生滑链现象，形成“stutter”峰。str标记一般是重复序列，在基因组上存在大量类似或相同的dna序列。在参考基因组不清楚时，难以设计特异性引物，容易出现非特异性扩增，无扩增产物等现象，造成分型错误。
3、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)是基因组上广泛存在的单个核苷酸突变，即点突变，被认为是继str后的第三代遗传标记。随着高通量测序技术的发展，大量个体重测序的完成，物种个体基因组内的细微差异被发现，促使研究人员从中开发出众多用途的snp遗传标记。snp广泛存在于基因组中，大约每1kb存在一个snp。str较snp突变率更高，在肿瘤样品中str遗传标记突变最为突出，snp的稳定性更高。snp标记的等位基因扩增片段长度相等，消除了str较短片段的扩增优势。大熊猫种群以二等位基因的snp位点最为常见，占总数的99.64％，仅0.36％的三等位基因snp位点和0.002％的四等位基因snp位点。在二等位基因snp位点中a/g和t/c基因型分别占33％，a/c和t/g分别占9％，a/t占8％，g/c占7％。因此，snp遗传标记的多态信息含量(polymorphism informationcontent，pic)较str低，研究人员则需要开发更多的snp标记位点。
4、随着二代测序技术的飞速发展及高准确性，2013年kidd团队基于长期的研究，将序列片段在200bp内，拥有两个及以上高度紧密连锁的snp位点且具有较高的多态性基因座定义为微单倍型(microhaplotype,mh)。微单倍型遗传标记继承了snp标记的优势，具有高稳定性、无“stutter”峰干扰、高多态性、短扩增片段、混合及降解检材适应性好等显著优势。目前，法医物证学领域的研究人员已开发了大量的微单倍型遗传标记，在个体识别、亲权鉴定、祖源推断、混合斑等方面的应用得到了突破性进展。迄今为止，国内外暂无研究人员开发大熊猫微单倍型遗传标记的研究报道。因此，有必要开发一批大熊猫专属的微单倍型标记，用于大熊猫的个体识别、亲缘关系鉴定、种群遗传多样性分析，混合检材识别，标识不清样本的鉴定等方面。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一组大熊猫常染色体微单倍型遗传标记以及用于检测该组微单倍型遗传标记的引物组。
2、本专利技术中，专利技术人基于成都大熊猫繁育研究基地已有圈养大熊猫重测序数据和ncbi/sra数据库中野生大熊猫重测序数据为基础，以最新发表的大熊猫基因组“gpv1”为参考基因组，用gatk突变调用工具生成大熊猫群体染色体几乎所有的遗传变异，最终筛选得到391个在大熊猫基因组中ae大于3、pic大于等于0.6、等位基因最小频数大于5且稳定遗传的候选微单倍型。针对这391个候选的微单倍型基因座，专利技术人综合基因座邻近突变、染色体分布，引物设计等因素，最终选择31个微单倍型标记形成一组高质量的大熊猫个体识别遗传标记。设计的引物组能扩增这31个大熊猫常染色体微单倍型标记的核苷酸序列，该组引物稳定性高、特异性强，扩增产物长度均不超过200bp，对野外粪便等易降解检材适应性好。
3、该组标记扩增引物的5’和3‘端分别添加通用gc-rich序列，既平衡了退火温度，又有利于数据分析。利用illumina pe150测序策略检测得到的31个基因座均具有良好的均一性。
4、本专利技术对于鉴定野外大熊猫个体、亲缘关系鉴定、种群遗传多样性分析、大熊猫珍惜样品溯踪具有重大的应用推广价值。
5、本专利技术提供了一套引物组，由62种引物组成，引物为单链dna分子，62种引物的核苷酸序列依次如序列表的序列1至序列62所示。
6、所述31个大熊猫微单倍型标记如下：mh01gp-002、mh01gp-003、mh02gp-004、mh02gp-005、mh02gp-006、mh02gp-007、mh03gp-008、mh03gp-009、mh04gp-010、mh05gp-011、mh06gp-012、mh06gp-013、mh07gp-014、mh07gp-015、mh08gp-016、mh08gp-017、mh09gp-018、mh10gp-019、mh11gp-020、mh12gp-021、mh12gp-022、mh14gp-024、mh15gp-025、mh16gp-026、mh16gp-027、mh17gp-028、mh17gp-029、mh19gp-030、mh19gp-031、mh19gp-032、mh20gp-034。
7、所述31个大熊猫微单倍型具体信息位置信息见表四，圈养种群各遗传标记统计指标见表五及表六。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于大熊猫个体识别的微单倍型遗传标记分型体系，其特征在于，包括62种引物，62种引物的核苷酸序列依次如序列表的序列1至62所示。
2.权利要求1所述引物组在大熊猫个体识别中的应用。
3.权利要求1所述引物组在大熊猫亲缘关系鉴定中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种用于大熊猫个体识别的微单倍型遗传标记分型体系，其特征在于，包括62种引物，62种引物的核苷酸序列依次如序列表的序列1至62所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈富军，许蔚，谢大鑫，唐琳，李严，张修月，刘红，王涓，张亮，吴孔菊，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：
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