【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种重组菌及其构建方法和在制备三萜类化合物中的应用。
技术介绍
1、细胞色素p450氧化酶(以下简称p450)和细胞色素p450氧化酶还原酶(以下简称cpr)广泛用于工程菌株中用于选择性催化碳氢键键的氧化，从而生成相应的羟基、醛基、酮基和羧基产物。由于p450的催化特性，往往较难控制产物中羟基、醛基、酮基和羧基产物的比例，进而导致副产物的积累。而当菌株中的需要利用多个p450对化合物多个位点进行氧化时，副产物的数量也会随之增加。以皂皮酸为例，其生物合成方法涉及到β-橡树酯醇3个位点的氧化。因为p450的催化特性，导致该氧化过程中副产物多达40个以上。传统的解决办法是通过对同功能的p450进行筛选，以选取最优的p450进行的过表达，从而提高特定氧化产物的产量。然而该方法依然难以改变产物的比例，无法解决副产物积累的问题。对酶进行改造从而改变酶的活性可以改变酶催化的产物比例，但是真核生物的p450多为膜蛋白，改造困难，通常对p450的酶细微改动都会导致酶的失活，影响目的产物的产量。
技术实现思路
1、基于此，有必要提供一种目的产物产量较高的重组菌及其构建方法和在制备三萜类化合物中的应用。
2、一种重组菌，所述重组菌中插入有至少两个不同的细胞色素p450氧化酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶基因催化同一位点的氧化反应，其中，每个所述细胞色素p450氧化酶基因分别独立选自cyp716a12、cyp72a68v2、cyp714e9、cy
3、上述重组菌插入有至少两个不同的细胞色素p450氧化酶基因，每个细胞色素p450氧化酶基因分别独立选自cyp716a12、cyp72a68v2、cyp714e9、cyp716a262和cyp72a567中的一种，不同的细胞色素p450氧化酶对目的产物的前体中同一个位点的碳氢键进行氧化，氧化效率较高，不易形成不完全氧化的产物羟基或过氧化产物羧基，降低副产物的产生，能够提高目的产物的产量。经试验验证，在能够产β-香树脂醇的酿酒酵母中插入不同的细胞色素p450氧化酶基因，不同的细胞色素p450氧化酶基因对β-香树脂醇c-28、c-23进行氧化，两个位点氧化效果较高，其生产天然三萜类化合物皂皮酸(接近100mg/l)、刺囊酸(176mg/l)、常春藤皂苷元(109mg/l)和齐墩果酸(205mg/l)的产量均较高。
4、在其中一个实施例中，所述重组菌中还插入有至少两个不同的细胞色素p450氧化酶还原酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因对同一位点进行催化反应。
5、在其中一个实施例中，其中一个所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因为sacpr1，另一个所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因为crcpr01。
6、在其中一个实施例中，所述重组菌中插入有cyp716a12、crcpr01、cyp716a262。
7、在其中一个实施例中，所述重组菌能够生产刺囊酸，cyp716a12和cyp716a262共表达能够提高所述重组菌的刺囊酸产量。
8、在其中一个实施例中，所述重组菌中还插入有cyp714e9、cyp72a68v2中的一个。
9、在其中一个实施例中，所述重组菌中还插入有cyp72a567。
10、在其中一个实施例中，所述重组菌中cyp72a567的拷贝数为至少2个。
11、在其中一个实施例中，所述重组菌能够生产皂皮酸，cyp72a567的拷贝数为2个，cyp714e19的拷贝数为1个，2个拷贝的cyp72a567和1个拷贝的cyp714e19能够促进所述重组菌的皂皮酸上c-23位点醛基的形成。
12、在其中一个实施例中，所述重组菌中还插入有cyp714e9。
13、在其中一个实施例中，所述重组菌中还插入有sacpr1。
14、在其中一个实施例中，所述重组菌为重组酿酒酵母菌株，所述重组菌中还插入有目的产物合成途径的关键酶基因。
15、在其中一个实施例中，所述目的产物为三萜类化合物。
16、一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：
17、将细胞色素p450氧化酶基因导入到底盘菌株中，以使所述底盘菌株中插入有至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶基因催化同一位点的氧化反应，得到重组菌，其中，每个所述细胞色素p450氧化酶基因分别独立选自cyp716a12基因、cyp72a68v2基因、cyp714e9基因、cyp716a262基因和cyp72a567基因中的一种。
18、在其中一个实施例中，所述将细胞色素p450氧化酶基因导入到底盘菌株中的步骤包括：
19、将所述细胞色素p450氧化酶基因和细胞色素p450氧化酶还原酶基因导入到所述底盘菌株中，以使所述底盘菌株中插入有至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶基因和至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因对同一位点进行催化反应，得到所述重组菌。
20、在其中一个实施例中，所述底盘菌株为携带有cyp716a12和crcpr01的产齐墩果酸的酵母菌株，所述将细胞色素p450氧化酶基因导入到底盘菌株中的步骤包括：
21、以酿酒酵母的gdna为模板，采用序列如seq id no.13所示的引物1622b-f和序列如seq id no.14所示的引物yqa07-r1进行pcr反应，得到1622b-up片段；
22、以重组载体为模板，采用序列如seq id no.15所示的引物yqa07-f2和序列如seqid no.16所示的引物yqa07-r2进行pcr反应，得到载体提取片段，所述重组载体携带有cyp716a262、cyp714e9或者cyp72a68v2；
23、以酿酒酵母的gdna为模板，序列如seq id no.17所示的引物yqa07-f3和序列如seq id no.18所示的引物1622b-r进行pcr反应，得到1622b-dn片段；
24、将1622b-up片段、所述载体提取片段和1622b-dn片段导入到所述底盘菌株，得到所述重组菌。
25、在其中一个实施例中，所述将细胞色素p450氧化酶基因导入到底盘菌株中的步骤之前，还包括构建所述底盘菌株的步骤：
26、以酿酒酵母的gdna为模板，采用序列如seq id no.7所示的引物911bup-f和序列如seq id no.8所示的引物yqa06-r1进行pcr反应，得到911b-up片段；
27、以质粒pc1r3为模板，采用序列如seq id no.9所示的引物yqa06-f2和序列如seqid no.10所示的引物yqa06-r2进行pcr反应，得到c1r3片段，所述质粒pc1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌中插入有至少两个不同的细胞色素P450氧化酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素P450氧化酶基因催化同一位点的氧化反应，其中，每个所述细胞色素P450氧化酶基因分别独立选自CYP716A12、CYP72A68V2、CYP714E9、CYP716A262和CYP72A567中的一种。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有至少两个不同的细胞色素P450氧化酶还原酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素P450氧化酶还原酶基因对同一位点进行催化反应。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，其中一个所述细胞色素P450氧化酶还原酶基因为SaCPR1，另一个所述细胞色素P450氧化酶还原酶基因为CrCPR01。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中插入有CYP716A12、CrCPR01、CYP716A262。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌能够生产刺囊酸，CYP716A12和CYP716A262共表达能够提高所述重组菌的刺囊酸产量
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有CYP714E9、CYP72A68V2中的一个。
7.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有CYP72A567。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中CYP72A567的拷贝数为至少2个。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌能够生产皂皮酸，CYP72A567的拷贝数为2个，CYP714E19的拷贝数为1个，2个拷贝的CYP72A567和1个拷贝的CYP714E19能够促进所述重组菌的皂皮酸上C-23位点醛基的形成。
10.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有CYP714E9。
11.根据权利要求10所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有SaCPR1。
12.根据权利要求1-11任一项所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组酿酒酵母菌株，所述重组菌中还插入有目的产物合成途径的关键酶基因，所述目的产物为三萜类化合物。
13.一种重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述将细胞色素P450氧化酶基因导入到底盘菌株中的步骤包括：
15.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，所述底盘菌株为携带有CYP716A12和CrCPR01的产齐墩果酸的酵母菌株，所述将细胞色素P450氧化酶基因导入到底盘菌株中的步骤包括：
16.根据权利要求15所述的构建方法，其特征在于，所述将细胞色素P450氧化酶基因导入到底盘菌株中的步骤之前，还包括构建所述底盘菌株的步骤：
17.根据权利要求16所述的构建方法，其特征在于，构建所述底盘菌株的步骤之前，还包括构建所述产β-橡树酯醇的酵母菌株的步骤包括：
18.根据权利要求15所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体携带有CYP716A262，所述将1622b-UP片段、所述载体提取片段和1622b-Dn片段导入到所述底盘菌株的步骤包括：
19.根据权利要求18所述的构建方法，其特征在于，所述将511b-UP片段、C12片段、PMS终止子片段和511b-Dn片段导入到所述产刺囊酸的酵母菌株中的步骤包括：
20.根据权利要求19所述的构建方法，其特征在于，所述将Met15-UP片段、C12B片段、TRP-Marker片段和Met15-Dn片段导入到所述第一酵母菌株中的步骤包括：
21.根据权利要求20所述的构建方法，其特征在于，所述将YPRcd15c-UP片段、C8片段、PDC6终止子2片段和YPRcd15c-Dn片段导入到所述第二酵母菌株中的步骤包括：
22.权利要求1-12任一项所述的重组菌或者权利要求13-21任一项所述的构建方法构建得到的重组菌在制备三萜类化合物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌中插入有至少两个不同的细胞色素p450氧化酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶基因催化同一位点的氧化反应，其中，每个所述细胞色素p450氧化酶基因分别独立选自cyp716a12、cyp72a68v2、cyp714e9、cyp716a262和cyp72a567中的一种。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有至少两个不同的细胞色素p450氧化酶还原酶基因，且至少两个不同的所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因对同一位点进行催化反应。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，其中一个所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因为sacpr1，另一个所述细胞色素p450氧化酶还原酶基因为crcpr01。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中插入有cyp716a12、crcpr01、cyp716a262。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌能够生产刺囊酸，cyp716a12和cyp716a262共表达能够提高所述重组菌的刺囊酸产量。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有cyp714e9、cyp72a68v2中的一个。
7.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有cyp72a567。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中cyp72a567的拷贝数为至少2个。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌能够生产皂皮酸，cyp72a567的拷贝数为2个，cyp714e19的拷贝数为1个，2个拷贝的cyp72a567和1个拷贝的cyp714e19能够促进所述重组菌的皂皮酸上c-23位点醛基的形成。
10.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有cyp714e9。
11.根据权利要求10所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还插入有sacp...
【专利技术属性】
技术研发人员：周豪宏，杨加增，刘宇光，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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