【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用。
技术介绍
1、阿洛酮糖又称d-阿洛酮糖，为d-果糖三号位碳所对应的差向异构体，阿洛酮糖具有与蔗糖相似的口感，但其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖的0.3％，且几乎不在体内代谢。并且由于可以通过抑制葡萄糖的吸收来抑制葡萄糖，因此具有降血糖的功效，是最具潜力的蔗糖替代品之一。
2、阿洛酮糖天然存在于葡萄干、无花果、猕猴桃和红糖等食物中，是自然界中含量极少的稀有单糖，依靠天然产物提取的方法成本高，且很难达到量产。现有技术中，制造d-阿洛酮糖的方法中有化学方法和生物方法。如比利克(bilik)等人曾研发利用钼酸离子的催化作用来由果糖生产阿洛酮糖的技术。麦克唐纳(mcdonald)通过对1,2:4,5-二-o-丙酮缩甘油-β-d-果糖进行三步骤化学处理过程来生产了阿洛酮糖。
3、但化学方法会产生大量的副产物和使用大量化学试剂，且生产效率并不高。近年来，生物方法制备阿洛酮糖以其安全、绿色、环保的优势而逐渐成为未来的主流趋势。早期，肯·伊兹莫里(kenizumori)等人证实了利用微生物细胞反应以半乳糖醇、d-塔格糖或d-塔罗糖醇为原料生产阿洛酮糖，但原料不易取得，成本高。经过前人的不断研究，现阶段的生物转化法主要是以果糖为原料，经d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成d-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式。
4、如申请号为201710124243.x公开的一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的应
5、但由于来源于野生菌株未经改造的d-阿洛酮糖3-差向异构酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。现有技术常通过改造菌体来提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化活性，如申请号为201610818847.x公开的一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用，该专利提供了d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，含有g86d、d164e、w262s突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，降低了合成d-阿洛酮糖过程中的酶的用量。
6、虽然现有技术通过突变等方式提高了酶的催化活性，但仍然存在用大肠杆菌或芽孢杆菌表达蛋白时有大量包涵体蛋白，表达出可溶蛋白效率较低的问题。且由于阿洛酮糖与果糖的差价较低，因此制备阿洛酮糖的关键因素在于酶的制备成本。基于此，如何构建出高效可溶性表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌株成为低成本制备阿洛酮糖的关键点。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供一种高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌及应用。本专利技术构建了高效表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌，该工程菌中包含构建的重组表达载体和共表达载体，提高了表达出可溶蛋白的效率，从而提高了d-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达水平。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了如下任意项在生产d-阿洛酮糖中的应用：
4、(ⅰ)、共表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子hce；和/或
5、(ⅱ)、共表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因、组成型启动子hce和rbs序列；和/或
6、(ⅲ)、共表达dnaj、dnak、groel和/或grpe；和/或
7、(ⅳ)、共表达dnaj、dnak、groel、grpe、rbs序列和/或lac启动子；
8、(ⅴ)、缺失lacz基因和共表达dnaj、dnak、groel和/或grpe。
9、本专利技术还提供了表达元件，所述表达元件包括表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子hce基因。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因来源于瘤胃球菌ruminococcus sp.；所述hce基因来源于芽孢杆菌geobacillus sp.wch70。
11、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达元件还包括rbs序列。
12、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述rbs序列于5’端添加。
13、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶具有：
14、(ⅰ)、如seq id no：1所示的氨基酸序列；
15、(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
16、(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列；
17、所述组成型启动子hce具有：
18、(ⅳ)、如seq id no:2所示核苷酸序列的dna片段；或
19、(ⅴ)、与(ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性，且具有启动子功能的dna片段。
20、在本专利技术的一些具体实施方案中，常用的载体均适用于该重组表达载体，没有特殊限制，优选的，所述载体为质粒，选择但不限于pet21a、pet20b、pet22b、pet28a中的任意一种；
21、进一步优选的，本专利技术采用的载体为pet28a质粒。
22、在上述研究的基础上，本专利技术还提供了共表达元件，所述共表达元件包括分子伴侣蛋白的基因和/或缺失lacz基因；
23、所述分子伴侣蛋白包括dnaj、dnak、groel和/或grpe。
24、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述dnaj、dnak、groel和/或grpe的基因来源于芽孢杆菌geobacillus sp.wch70。
25、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述共表达元件包括如下任意项和/或缺失lacz基因：
26、(ⅰ)、依次包括dnaj、dnak、groel和grpe；和/或
27、(ⅱ)、依次包括dnaj、dnak、grpe和groel。
28、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述缺失lacz基因采用的质粒grna-1具有：
29、(a)、如seq id no:15所示的核苷酸序列；或
30、(b)、与(a)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(a)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
31、(c)、与(a)或(b)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(a)或(b)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
32、(d)、与(a)～(c)任一项所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
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【技术保护点】
1.如下任意项在生产D-阿洛酮糖中的应用：
2.表达元件，其特征在于，所述表达元件包括表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子HCE基因。
3.如权利要求2所述的表达元件，其特征在于，还包括RBS序列。
4.如权利要求2或3所述的表达元件，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有：
5.共表达元件，其特征在于，所述共表达元件包括分子伴侣蛋白的基因和/或缺失lacZ基因；
6.如权利要求5所述的共表达元件，其特征在于，包括如下任意项和/或缺失lacZ基因：
7.如权利要求5或6所述的共表达元件，其特征在于，还包括RBS序列和/或lac启动子。
8.如权利要求5至7任一项所述的共表达元件，其特征在于，包括如下任意项：
9.如权利要求5至8任一项所述的共表达元件，其特征在于，所述dnaJ基因的核苷酸序列具有：
10.表达载体，其特征在于，包括如下任意项：
11.如权利要求10所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括：将如下任意项进行全合成，插入载体的
12.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
13.如权利要求12所述的宿主，其特征在于，包括工程菌；
14.如权利要求13所述的宿主，其特征在于，所述工程菌的构建方法包括转入如下任意项：
15.如下任意项在生产D-阿洛酮糖中的应用：
16.如下任意项在生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用：
17.如下任意项在制备降血糖药物中的应用：
18.D-阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，基于如下任意项制得D-阿洛酮糖：
19.如权利要求18所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.如下任意项在生产d-阿洛酮糖中的应用：
2.表达元件，其特征在于，所述表达元件包括表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因和组成型启动子hce基因。
3.如权利要求2所述的表达元件，其特征在于，还包括rbs序列。
4.如权利要求2或3所述的表达元件，其特征在于，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶具有：
5.共表达元件，其特征在于，所述共表达元件包括分子伴侣蛋白的基因和/或缺失lacz基因；
6.如权利要求5所述的共表达元件，其特征在于，包括如下任意项和/或缺失lacz基因：
7.如权利要求5或6所述的共表达元件，其特征在于，还包括rbs序列和/或lac启动子。
8.如权利要求5至7任一项所述的共表达元件，其特征在于，包括如下任意项：
9.如权利要求5至8任一项所述的共表达元件，其特征在于，所述dn...
【专利技术属性】
技术研发人员：华君，裴亮，李政泓，潘月，刘超，
申请(专利权)人：四川盈嘉合生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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