【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业有害生物快速检测，具体涉及基于rpa-crispr/cas12a可视化检测豇豆疫霉菌的方法及应用。
技术介绍
1、由豇豆疫霉菌（ phytophthora vignae）侵染所致的豇豆疫病是豇豆成株期主要病害，适宜发病温度为25-28 ℃，并且随着雨水增多、湿度增大，病害亦趋严重，所以春季连续阴雨和梅雨期间是疫病高发期。其次，若通风不好、排水不良、施用不腐熟基肥或连作地，发病亦较重。其病原豇豆疫霉菌（ phytophthora vignae）是疫霉属卵菌，隶属于藻菌界，卵菌门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科。目前为止，对该病害的检测诊断主要是症状诊断和病原分离鉴定。传统的病原菌检测方法程序繁琐，所需时间长，且必须拥有病原菌详细的分类资料，满足不了病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求。因此，建立一套快速、灵敏、准确的豇豆疫霉菌检测技术非常必要且十分迫切。
2、目前，对植物病害的传统检测鉴定方法是首先进行病菌分离，通过对已经分离并纯化的病菌进行培养，观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到植株中，进行致病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起病害的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用，有着很强实用性，是病原菌的鉴定及病害检测的方法之一，但是该方法受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。
3、免疫学检测技术（immuno
4、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）是一种利用dna聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定、变异检测等分子生物学研究。pcr检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原菌检测重要的技术之一，主要包括常规pcr、巢式pcr（nest-pcr）和实时荧光定量pcr等，主要的缺点是需要依靠pcr等仪器设备，不利于基层生产上推广应用。
5、环介导等温扩增（loop-mediated isthermal amplification，lamp）技术是由日本科学家开发的一种最新的简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法。lamp技术是一种新型的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下，可在短时间内使产物得到大量扩增，在短短的30min～60min内就能实现109～1010倍的扩增。同时具有很高的灵敏度和特异性，且操作简便，无需特殊实验设备，但该方法如通过产物的浊度进行判断易发生误判，其余结果判定需要开盖进行检测，易导致气溶胶污染。
6、综上，目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力，时间周期长且灵敏度不高，检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，pcr技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用；环介导等温扩增技术（lamp），可以根据菌株特有序列设计引物并进行特异序列扩增，从而达到菌株鉴定目的，该方法仅在65℃恒温下完成，无需额外的仪器设备，但该方法如通过产物的浊度进行判断易发生误判，其余结果判定需要开盖进行检测，易导致气溶胶污染。
7、crispr及crispr相关蛋白（crispr associated proteins，cas）被称为crispr/cas系统。cas12a为第2类v型cas蛋白，它在未激活时无切割活性，当其与特定的crrna结合后，cas12a构象将发生改变，与crrna结合形成cas12a-crrna二元复合物。该复合物能特异性地识别靶标dna，并激活其核酸内切酶活性。当cas12a依次对dna双链进行顺式切割后，该活性位点将持续暴露，展现出反式切割活性，对周围的ssdna进行非特异性切割。针对cas12a的特性，科学家们设计了多种高灵敏度、高特异性的核酸检测平台。crispr/cas12a蛋白可以在sgrna的引导下对目的序列进行特异切割同时激活反式切割活性，对探针进行随机切割从而产生荧光，然而，使用单一的crispr/cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术（如重组酶聚合酶扩增，rpa）与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种基于rpa扩增结合crispr/cas12a体系的可视化检测豇豆疫霉菌的引物、试剂盒以及检测方法，本专利技术的方法无需在扩增后开盖加入crispr/cas12a体系，具有易于操作、快速灵敏、鉴定结果准确、有效避免气溶胶污染等特点。
2、本专利技术第一方面的目的，在于提供用于一种检测豇豆疫霉菌的试剂。
3、本专利技术第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
4、本专利技术第三方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的试剂和/或本专利技术第二方面的试剂盒的应用。
5、本专利技术第四方面的目的，在于提供一种基于crispr/cas12a的豇豆疫霉菌的检测方法。
6、为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
7、本专利技术的第一个方面，提供一种检测豇豆疫霉菌的试剂，所述试剂包括检测豇豆疫霉菌的crrna和/或豇豆疫霉菌基因组的引物对；
8、所述引物对为rpa-f/rpa-r，核苷酸序列如下：
9、rpa-f：5’-gcaagattgcttggttgagttctacagcag-3’；
10、rpa-r：5’-gcggttggagaactcgccatggtacttctc-3’；
11、所述crrna的核苷酸序列如seq id no:4所示。
12、本专利技术的第二个方面，提供一种包含本专利技术第一方面的试剂盒。
13、在本专利技术一些实施方式中，所述试剂盒还包括cas蛋白和ssdna荧光探针。
14、在本专利技术一些实施方式中，所述cas蛋白选自fncas12a、mb4cas12a、lbcas12a或dlbcas12a中的至少一种。
15、在本专利技术一些实施方式中，所述ssdna荧光探针包含核酸序列，所述核酸序列的5'端修饰荧光基团，3 '端修饰淬灭基团。
16、在本专利技术一些实施方式中，所述ssdna荧光探针的核苷酸序列为5’- ccaccc -3’。
17、在本专利技术一些实施方式中，所述荧光基团为fam、hex、htx、vic、tamra、rox和cy5中的至少一种；进一步为fam。
18、在本专利技术一些实施方式中，所述淬灭基团为bhq1、bhq2和bhq3中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测豇豆疫霉菌的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测豇豆疫霉菌的crRNA和/或豇豆疫霉菌基因组的引物对；
2.一种试剂盒，包含权利要求1所述的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白和ssDNA荧光探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas蛋白选自FnCas12a、Mb4Cas12a、LbCas12a或dLbCas12a中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针包含核酸序列，所述核酸序列的5 '端修饰荧光基团，3 '端修饰淬灭基团。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA反应液和CRISPR-Cas12a缓冲液。
7.权利要求1所述的试剂和/或权利要求2～6中任一项所述的试剂盒在1）～4）中任一项中的应用：
8.一种基于RPA结合CRISPR/Cas12a的豇豆疫霉菌的检测方法，包括采用权利要求1所述的试剂和/或权利要求2～6中任一项所述的试剂盒的步骤。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述RPA扩增的条件为37～42℃反应5～30分钟；和/或，所述步骤（3）中CRISPR的反应体系中crRNA的终浓度为500～800 nM，Cas蛋白的终浓度为500～800 nM，ssDNA荧光探针的终浓度为25～100 μM。
...【技术特征摘要】
1.一种检测豇豆疫霉菌的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测豇豆疫霉菌的crrna和/或豇豆疫霉菌基因组的引物对；
2.一种试剂盒，包含权利要求1所述的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas蛋白和ssdna荧光探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述cas蛋白选自fncas12a、mb4cas12a、lbcas12a或dlbcas12a中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述ssdna荧光探针包含核酸序列，所述核酸序列的5 '端修饰荧光基团，3 '端修饰淬灭基团。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括rpa反应液和cri...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈庆河，林明泽，冯婉珍，陆圣诞，
申请(专利权)人：海南大学三亚南繁研究院，
类型：发明
国别省市：
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