一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用技术

技术编号：41470614 阅读：7 留言：0更新日期：2024-05-30 14:24

本发明专利技术提供了一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株以E.coli W3110为底盘微生物，经代谢工程方法改造后，所述菌株缺失了deoD、xapA、gsk、purR基因；过表达了guaB、guaA、surE、prsA<supgt;*</supgt;基因，其中prsA<supgt;*</supgt;基因双拷贝；异源表达了来源于B.subtilis168的purF<supgt;*</supgt;、pur(EKBCSQLFMNHD)基因，其中purF<supgt;*</supgt;基因双拷贝；所述菌株具有良好的鸟苷合成能力，性能稳定，经5L发酵罐发酵48h，最终鸟苷的产量可达到35g/L，在目前已报道的利用大肠杆菌生产鸟苷中属于最高水平，具有很好的工业应用价值。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种鸟苷生产菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

1、鸟嘌呤核苷，又名 9-β-d-呋喃核糖基鸟嘌呤，简称鸟苷（gr），英文名guanosine。鸟苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂──5'-鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠以及核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造无环鸟苷（acyclovir）、三氮唑核苷（atc）、三磷酸鸟苷钠（gtp）等药物的主要原料。

2、近年来，鸟苷在工业上的主要生产方法为微生物发酵法，其所使用的生产菌株主要为芽孢杆菌，但利用芽孢杆菌发酵生产鸟苷存在一些问题，例如生产周期过长，容易染菌，导致发酵过程不稳定，并且生产成本较高，因此，如何缩短发酵周期，降低生产成本是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种鸟苷生产菌株。

2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述鸟苷生产菌株的构建方法。

3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述鸟苷生产菌株的应用。

4、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：

5、一种鸟苷生产菌株，为gus12鸟苷生产菌株，以 e.coliw3110作为出发菌株，经改造后，缺失了 deod、 xapa、 gsk、

6、优选的，上述鸟苷生产菌株，以 e.coliw3110作为出发菌株，敲除了菌株基因组上的 deod、 xapa、 gsk、 purr基因；利用t7启动子分别强化 guab、 guaa、 sure基因转录强度，并分别整合到基因组 mbha、 yeel、 ycgh基因位点；利用trc启动子强化 prsa*基因转录强度，并分别整合到基因组 yeep、 yjgx基因位点进行双拷贝；利用trc启动子强化来源于 b.subtilis168的 purf *,并分别整合到基因组 gapc、 ycdn基因位点进行双拷贝；利用trc启动子强化来源于 b.subtilis168的 pur(ekbcsqlfmnhd)基因转录强度，并整合到基因组 yjiv基因位点。

7、优选的，上述鸟苷生产菌株，所述出发菌株为 e.coliw3110 atcc 27325。

8、优选的，上述鸟苷生产菌株，所述 deod基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示， xapa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示， gsk基因的核苷酸序列如序列表seqid no.3所示， purr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示， guab基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示， guaa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示， sure基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示， prsa*基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示， purf *基因的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示， pur(ekbcsqlfmnhd)基因的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示，t7启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示。

9、优选的，上述 prsa*基因： prsa基因的第385位碱基a替换为c，其对应的第128位氨基酸由天冬氨酸替换为丙氨酸。

10、优选的，上述 purf *基因： purf基因的第878位碱基a替换为t，其对应的第293位氨基酸由天冬氨酸替换为缬氨酸；第946位碱基a替换为c，其对应的第316位氨基酸由赖氨酸替换为谷氨酰胺；第1199位碱基由c替换为g，第1200为碱基由c替换为g，其对应的第400位氨基酸由丝氨酸替换为色氨酸；该基因来源于 b.subtilis168。

11、上述鸟苷生产菌株的构建方法，在出发菌株 e.coliw3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：

12、（1）底盘菌改造：

13、异源表达了来源于b.subtilis168的嘌呤操纵子 pur(ekbcsqlfmnhd)基因，并由trc启动子控制；敲除了鸟苷激酶 gsk基因；敲除了嘌呤核苷酸合成抑制因子 purr基因；

14、（2）弱化鸟苷分解的基因转录强度：

15、敲除嘌呤核苷磷酸化酶 deod、 xapa基因，保留了其功能相同的 yfih、 yaie基因；

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【技术保护点】

1.一种鸟苷生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110作为出发菌株，经改造后，缺失了deoD、xapA、gsk、purR基因；过表达了guaB、guaA、surE、prsA*基因；异源表达了来源于B.subtilis168的purF*、pur(EKBCSQLFMNHD)基因。

2.根据权利要求1所述的鸟苷生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110作为出发菌株，敲除了菌株基因组上的deoD、xapA、gsk、purR基因；利用T7启动子分别强化guaB、guaA、surE基因转录强度，并分别整合到基因组mbhA、yeeL、ycgH基因位点；利用Trc启动子强化prsA*基因转录强度，并分别整合到基因组yeeP、yjgX基因位点进行双拷贝；利用Trc启动子强化来源于B.subtilis168的purF*,并分别整合到基因组gapC、ycdN基因位点进行双拷贝；利用Trc启动子强化来源于B.subtilis168的pur(EKBCSQLFMNHD)基因转录强度，并整合到基因组yjiV基因位点。

3.根据权利要求1或2所述的鸟苷生产菌株，其特征在于：所

4.根据权利要求1或2所述的鸟苷生产菌株，其特征在于：所述deoD基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，xapA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，gsk基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，purR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，guaB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，guaA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，surE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，prsA*基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，purF*基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，pur(EKBCSQLFMNHD)基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，Trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。

5.权利要求1-4之一所述鸟苷生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体方法如下：

6.根据权利要求5所述的鸟苷生产菌株的构建方法，其特征在于：所述yfiH基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，yaiE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示。

7.权利要求1-4之一所述鸟苷生产菌株在发酵生产鸟苷方面的应用。

8.根据权利要求7所述的鸟苷生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：

9.根据权利要求8所述的鸟苷生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为葡萄糖25-35g/L，酵母粉3-5g/L，蛋白胨0.8-1.2g/L，MgSO4.7H2O 0.5-1g/L，KH2PO42-3g/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，FeSO4.7H2O 10-20mg/L，VB1、VB3、VB5各0.8-1.5mg/L，VH0.5-1mg/L，其余为水。

10.根据权利要求8所述的鸟苷生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤③采用的发酵培养基为：酵母粉3-5g/L，蛋白胨1.5-2.5g/L，柠檬酸1.5-2.5mg/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，KH2PO42-5g/L，MgSO4.7H2O 1.5-2.5g/L，DPF 0.8-1.5g/L，FeSO4.7H2O 20-30mg/L，MnSO410-15mg/L，VB1、VB3、VB5各2-3mg/L，VH 0.5-0.5mg/L，其余为水。

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【技术特征摘要】

1.一种鸟苷生产菌株，其特征在于：以e.coli w3110作为出发菌株，经改造后，缺失了deod、xapa、gsk、purr基因；过表达了guab、guaa、sure、prsa*基因；异源表达了来源于b.subtilis168的purf*、pur(ekbcsqlfmnhd)基因。

2.根据权利要求1所述的鸟苷生产菌株，其特征在于：以e.coli w3110作为出发菌株，敲除了菌株基因组上的deod、xapa、gsk、purr基因；利用t7启动子分别强化guab、guaa、sure基因转录强度，并分别整合到基因组mbha、yeel、ycgh基因位点；利用trc启动子强化prsa*基因转录强度，并分别整合到基因组yeep、yjgx基因位点进行双拷贝；利用trc启动子强化来源于b.subtilis168的purf*,并分别整合到基因组gapc、ycdn基因位点进行双拷贝；利用trc启动子强化来源于b.subtilis168的pur(ekbcsqlfmnhd)基因转录强度，并整合到基因组yjiv基因位点。

3.根据权利要求1或2所述的鸟苷生产菌株，其特征在于：所述出发菌株为e.coliw3110atcc 27325。

4.根据权利要求1或2所述的鸟苷生产菌株，其特征在于：所述deod基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，xapa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，gsk基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，purr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示，guab基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示，guaa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示，sure基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，prsa*基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示，purf*基因的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，李良文，陈志超，时唐恩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：

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