【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及rna提取，具体涉及一种用于自动化总rna的提取方法和应用。
技术介绍
1、核酸是所有生物体的遗传物质，包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)两类。rna是一个极为重要的生物分子，普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，能够在细胞内传递遗传信息，并且参与到生物体内各种代谢活动的调节和调控中。rna的转录和加工过程中存在很多调节机制，这些机制已经被广泛应用到基因工程和临床治疗中。
2、随着生物技术的发展，科学家们对rna的研究也越来越深入，以rna为研究对象的生物技术，包括全基因组rna测序、rna酶保护实验、rna干扰、rna递送等一系列技术，近年来飞速发展。而rna研究的第一步，就是要从各种生物样品中提取高质量的rna，rna的提取效率成为下游研究能否成功的制约因素。由于rna提取的重要地位，全球的科学家们开发了一系列rna提取方法，包括传统的酚/氯仿抽提法、主流的硅胶膜吸附柱法以及适用于自动化工作平台的磁珠法等。
3、临床上检出病毒遗传物质的rna可以作为rna病毒是否存在的依据，快速、有效、准确的诊断出何种病毒，是病原诊断、疫情监测和疾病控制蔓延的重要前提。显然，传统的酚氯仿抽提、常规的硅胶膜吸附柱法已经不能适应疫情大范围大规模爆发的情况下分子诊断业务发展的需要。
4、在磁珠法rna提取领域，全球著名的头部生物技术公司，如qiagen ez1、thermofisher magmax、promega magnasil、roche magnapure comp
5、真正意义上的自动化rna提取是“样品进，产物出”，是指手动法rna提取所使用的试剂都预先分装在封闭的反应腔体内，使用时只需要将样品加入到自定义的反应腔体内，一键启动程序，磁珠按照预先设定的程序，在不同的反应腔体内自动转移，完成rna提取的全过程。磁珠法rna提取的主要优势在于自动化高通量，如果不利于自动化操作，则相比其他方法无优势。专利cn117070510a公布了一种通用型总rna提取方法及提取试剂盒，该专利虽然提供了适用于市场上各类全自动化核酸提取设备的总rna提取方法，使用dna酶i消化去除基因组dna的污染，dna酶i是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。dna酶i活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在下，dna酶i可随机剪切双链dna的任意位点；二价锰离子存在的条件下，dna酶i可在同一位点剪切dna双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的黏末端。但是，该方法在dna酶i消化反应后，rna会从磁珠上游离到体系中，需要手动添加洗涤液ii到dna酶i消化反应体系中，利用洗涤液ii使rna重新结合在磁珠上，这一步会造成，dna酶i反应后，体系中rna已经与磁珠脱离，需要手动加入洗涤液ii到磁珠反应体系后，让rna与磁珠重新结合，才能转移结合有rna的磁珠到下一步反应液中，不利于自动化提取。因此，本领域迫切需要开发一种用于自动化总rna的提取方法，以此来解决当前的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于自动化总rna的提取方法和应用，其目的在于根据rna和dna在盐溶液中的溶解度、带电性质的不同，使用dna酶i并搭配特殊的dna酶i缓冲液消化去除dna，在该体系中，dna酶i切割消化dna，同时rna仍然结合在磁珠表面，待dna消化完全后，不需再往体系中添加溶液辅助rna重新结合到磁珠表面，可直接转移磁珠到下一步反应液中，实现rna提取的完全自动化，而且避免了提取反应过程中手动添加试剂造成的rna降解风险，并且能够用于细胞、动物组织和细菌中总rna的提取，由此解决现有磁珠法总rna提取方法难以实现自动化的技术问题。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、1、一种用于自动化总rna的提取方法，具体步骤包括以下步骤：
4、1)裂解结合：收集待测样本，加入裂解结合液，震荡混匀，直至样本完全裂解，向反应体系中加入磁珠溶液，混匀静置3-5min，将体系置于磁力架上，磁分离后吸弃上清；
5、2)wash i洗杂：向上述步骤1)中加入wash i，清洗磁珠混合物，磁分离后吸弃上清；
6、3)dna酶i消化：向上述步骤2)中依次加入dna酶i缓冲液和dna酶i，混匀后，室温静置15-20min，待dna消化完全后，磁分离，弃上清；
7、4)洗杂、洗脱：向上述步骤3)中加入wash ii，清洗磁珠表面2次，磁分离后，吸弃上清，加入rnase free ddh2o，室温静置1-5min，磁分离，收集上清，获得总rna。
8、优选的，所述用于自动化总rna的提取方法，其所述裂解结合液，包括：1-6m异硫氰酸胍，10-50mm三羟甲基氨基甲烷，1-5mm乙二胺四乙酸二钠，0.1-1％曲拉通x-100，1-5％聚乙二醇8000，20-50％异丙醇,2％β-巯基乙醇；
9、优选的，所述wash i，包括0.1-1m盐酸胍，5-50mm乙酸钾，20-50％无水乙醇；
10、优选的，所述washii，包括60-80％无水乙醇；
11、优选的，所述dna酶i消化，按照5-25u/样本加入dna酶i；
12、优选的，所述磁珠溶液为硅羟基磁珠，粒径范围100-1000nm，固含量1-50mg/ml。
13、优选的，所述缓冲液为dna酶i缓冲液，包括5-10mm三羟甲基氨基甲烷，5-2.5mm氯化镁，0.01-0.2mm氯化钙，0.5-2m氯化钠，20％-50％甘油。
14、本专利技术的有益效果在于：本方法首次成功的将dna酶i清除基因组dna的方法运用到自动化总rna提取上，本方法根据rna、dna在盐溶液中的溶解度、带电性质的不同以及磁珠的结合特性，搭配特殊的dna酶i缓冲液，实现dna酶i消化反应和rna的磁珠结合反应在同一体系中不受干扰，dna酶i消化dna的同时，rna仍然结合在磁珠上，待dna酶i消化反应结束后，可直接转移结合有rna的磁珠，进行下一步反应，实现rna提取的完全自动化，可以避免因中途操作手动添加试剂造成的污染风险，使用该方法提取的总rna质量和完整性较传统方法更高，且能够用于细胞、动物组织和细菌中总rna的自动化提取。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于自动化总RNA的提取方法，具体步骤包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA来源于细胞、动物组织和细菌中的总RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解结合液，包括：1-6M异硫氰酸胍，10-50mM三羟甲基氨基甲烷，1-5mM乙二胺四乙酸二钠，0.1-1％曲拉通X-100，1-5％聚乙二醇8000，20-50％异丙醇，2％β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Wash I，包括0.1-1M盐酸胍，5-50mM乙酸钾，20-50％无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Wash II，包括60-80％无水乙醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA酶I消化，按照5-25U/样本加入DNA酶I。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠溶液为硅羟基磁珠，粒径范围100-1000nm，固含量1-50mg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA酶I缓冲液，包括5
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法在细胞、动物组织和细菌中总RNA的提取中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于自动化总rna的提取方法，具体步骤包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rna来源于细胞、动物组织和细菌中的总rna。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解结合液，包括：1-6m异硫氰酸胍，10-50mm三羟甲基氨基甲烷，1-5mm乙二胺四乙酸二钠，0.1-1％曲拉通x-100，1-5％聚乙二醇8000，20-50％异丙醇，2％β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述wash i，包括0.1-1m盐酸胍，5-50mm乙酸钾，20-50％无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：沙晓姣，曹飞婷，方利，
申请(专利权)人：常州伯仪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。