【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、基因疗法提供了治疗多种疾病的持久手段的可能性。基因疗法治疗的最新发展采用病毒或非病毒载体的使用。目前有若干种技术用于产生基因疗法载体。
2、例如，杆状病毒表达载体系统(bevs)是用于产生基因疗法载体的已确立系统。在该系统中，将昆虫宿主细胞用重组杆状病毒感染。昆虫宿主细胞提供了必要的蛋白质加工机制以产生由重组杆状病毒编码的产物。bevs已被用于产生用于许多不同应用的产品，包括疫苗、治疗性蛋白质、蛋白质结晶学以及用于基础和应用研究的产品。当生产用于基因疗法的病毒载体时，经常使用若干种杆状病毒表达载体并将其感染到昆虫宿主细胞中。每一种杆状病毒表达载体的产生是耗时的，并且抬高了生产成本。
3、因此，本领域需要改进的杆状病毒表达载体系统，同时避免现有系统的局限性。
技术实现思路
1、本文提供了一种杆状病毒表达载体系统，其包含杆状病毒穿梭载体(杆粒)和/或经工程化以产生治疗性药物产品的稳定细胞系。本文提供的杆状病毒表达载体系统包含含有两个或更多个外来序列插入位点的重组杆粒，和一个或多个能够介导外来序列(例如，异源基因)插入所述外来序列插入位点中的供体载体。
2、在一方面，本文提供了一种杆粒，所述杆粒包含：细菌复制子；选择性标记序列；包含用于插入转座子的第一优先靶位点的第一报告基因；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的第二优先靶位点。
3、在某些示例性实施方案中，所述细菌复制子是低拷贝
4、在某些示例性实施方案中，所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
5、在某些示例性实施方案中，所述第一报告基因编码能够代谢生色底物的酶。在某些示例性实施方案中，所述酶是laczα或其功能部分。在某些示例性实施方案中，所述生色底物是蓝色-gal或x-gal。
6、在某些示例性实施方案中，用于插入转座子的所述第一优先靶位点不破坏所述第一报告基因的阅读框。在某些示例性实施方案中，所述第一优先靶位点是细菌转座子的附着位点。在某些示例性实施方案中，所述第一优先靶位点是t7转座子的附着位点。在某些示例性实施方案中，所述转座子是t7转座子。
7、在某些示例性实施方案中，所述第二报告基因编码荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，所述荧光蛋白是红色荧光蛋白。
8、在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒诱导型启动子是39k启动子。
9、在某些示例性实施方案中，第二优先靶位点包含loxp位点或其变体。
10、在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由cre重组酶介导。
11、在另一方面，本文提供了一种杆粒，所述杆粒包含：微型f复制子；抗生素抗性基因；包含t7转座子附着位点的laczα基因或其功能部分；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及loxp位点或其变体。
12、在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一选择性标记序列；插入第一报告基因中的异源序列，其中所插入的异源序列破坏了所述第一报告基因的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
13、在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含异源基因。在某些示例性实施方案中，所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
14、在某些示例性实施方案中，所述异源序列还包含表达控制序列。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
15、在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期基因启动子。在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
16、在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
17、在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的rep蛋白。在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是细小病毒rep蛋白。在某些示例性实施方案中，所述细小病毒rep蛋白选自b19 rep、aav2 rep、hbov1 rep和gpv rep。
18、在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含第二选择性标记序列。在某些示例性实施方案中，所述第二选择性标记序列包含庆大霉素抗性基因。
19、在某些示例性实施方案中，所述细菌复制子是微型f复制子。在某些示例性实施方案中，所述第一选择性标记序列包含卡那霉素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述第一报告基因编码laczα或其功能部分。在某些示例性实施方案中，所述第二报告基因编码红色荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39k启动子。在某些示例性实施方案中，所述第二优先靶位点包含loxp位点或其变体。在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由cre重组酶介导。
20、在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型atttn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码rep，并且其中所插入的rep破坏了laczα基因或其功能部分的阅读框；以及loxp位点或其变体。
21、在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型atttn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码rep，并且其中所插入的rep破坏了laczα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及loxp位点或其变体。
22、在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型atttn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码b19 rep，并且其中所插入的b19 rep破坏了laczα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及loxp位点或其变体。
23、在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型atttn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码gpv rep，并且其中所插入的gpv rep破坏了laczα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及loxp位点或其变体。
24、在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型atttn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码aav2rep，并且其中所插入的aav2 rep破坏了laczα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杆粒，所述杆粒包含：
2.根据权利要求1所述的杆粒，其中所述细菌复制子是低拷贝数复制子。
3.根据权利要求2所述的杆粒，其中所述低拷贝数复制子是微型F复制子。
4.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的杆粒，其中所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
6.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一报告基因编码能够代谢生色底物的酶。
7.根据权利要求6所述的杆粒，其中所述酶是LacZα或其功能部分。
8.根据权利要求6或7所述的杆粒，其中所述生色底物是蓝色-gal或X-gal。
9.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中用于插入转座子的所述第一优先靶位点不破坏所述第一报告基因的阅读框。
10.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一优先靶位点是细菌转座子的附着位点。
11.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一优先靶位点是T7转座子的附着位点。
12.根据权利要求11所述的
13.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第二报告基因编码荧光蛋白。
14.根据权利要求13所述的杆粒，其中所述荧光蛋白是红色荧光蛋白。
15.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39K启动子。
16.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第二优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
17.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
18.一种杆粒，所述杆粒包含：
19.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
20.根据权利要求19所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含异源基因。
21.根据权利要求19或20所述的重组杆粒，其中所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
22.根据权利要求20或21所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含表达控制序列。
23.根据权利要求22所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
24.根据权利要求22或23所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。
25.根据权利要求24所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期基因启动子。
26.根据权利要求24或25所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的Rep蛋白。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是细小病毒Rep蛋白。
30.根据权利要求29所述的重组杆粒，其中所述细小病毒Rep蛋白选自B19 Rep、AAV2Rep、HBoV1 Rep和GPV Rep。
31.根据权利要求19-30中任一项所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含第二选择性标记序列。
32.根据权利要求31所述的重组杆粒，其中所述第二选择性标记序列包含庆大霉素抗性基因。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的重组杆粒，其中所述细菌复制子是微型F复制子。
34.根据权利要求19-33中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一选择性标记序列包含卡那霉素抗性基因。
35.根据权利要求19-34中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一报告基因编码LacZα或其功能部分。
36.根据权利要求19-35中任一项所述的重组杆粒，其中所述第二报告基因编码红色荧光蛋白。
37.根据权利要求19-36中任一项所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39K启动子。
38.根据权利要求19-37中任一项所述的重组杆粒，其中所述优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
39.根据权利要求19-38中任一项所述的重组杆粒，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
40.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
41.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
42.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
43.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
44...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种杆粒，所述杆粒包含：
2.根据权利要求1所述的杆粒，其中所述细菌复制子是低拷贝数复制子。
3.根据权利要求2所述的杆粒，其中所述低拷贝数复制子是微型f复制子。
4.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的杆粒，其中所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
6.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一报告基因编码能够代谢生色底物的酶。
7.根据权利要求6所述的杆粒，其中所述酶是laczα或其功能部分。
8.根据权利要求6或7所述的杆粒，其中所述生色底物是蓝色-gal或x-gal。
9.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中用于插入转座子的所述第一优先靶位点不破坏所述第一报告基因的阅读框。
10.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一优先靶位点是细菌转座子的附着位点。
11.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一优先靶位点是t7转座子的附着位点。
12.根据权利要求11所述的杆粒，其中所述转座子是t7转座子。
13.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第二报告基因编码荧光蛋白。
14.根据权利要求13所述的杆粒，其中所述荧光蛋白是红色荧光蛋白。
15.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39k启动子。
16.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第二优先靶位点包含loxp位点或其变体。
17.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述位点特异性重组事件由cre重组酶介导。
18.一种杆粒，所述杆粒包含：
19.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
20.根据权利要求19所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含异源基因。
21.根据权利要求19或20所述的重组杆粒，其中所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
22.根据权利要求20或21所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含表达控制序列。
23.根据权利要求22所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
24.根据权利要求22或23所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。
25.根据权利要求24所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期基因启动子。
26.根据权利要求24或25所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的rep蛋白。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是细小病毒rep蛋白。
30.根据权利要求29所述的重组杆粒，其中所述细小病毒rep蛋白选自b19 rep、aav2rep、hbov1 rep和gpv rep。
31.根据权利要求19-30中任一项所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含第二选择性标记序列。
32.根据权利要求31所述的重组杆粒，其中所述第二选择性标记序列包含庆大霉素抗性基因。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的重组杆粒，其中所述细菌复制子是微型f复制子。
34.根据权利要求19-33中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一选择性标记序列包含卡那霉素抗性基因。
35.根据权利要求19-34中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一报告基因编码laczα或其功能部分。
36.根据权利要求19-35中任一项所述的重组杆粒，其中所述第二报告基因编码红色荧光蛋白。
37.根据权利要求19-36中任一项所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39k启动子。
38.根据权利要求19-37中任一项所述的重组杆粒，其中所述优先靶位点包含loxp位点或其变体。
39.根据权利要求19-38中任一项所述的重组杆粒，其中所述位点特异性重组事件由cre重组酶介导。
40.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
41.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
42.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
43.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
44.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
45.一种核酸载体，所述核酸载体包含：
46.根据权利要求45所述的载体，其中所述第一复制起点是以pi蛋白的存在为条件的。
47.根据权利要求45或46所述的载体，其中所述第一复制起点是r6kγ。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的载体，其中所述第一细菌株包含pi蛋白。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的载体，其中所述第二复制起点是puc57。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的载体，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
51.根据权利要求50所述的载体，其中所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的载体，其中所述报告基因编码荧光蛋白。
53.根据权利要求52所述的载体，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
54.根据权利要求45-53中任一项所述的载体，其中所述优先靶位点包含loxp位点或其变体。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的载体，其中所述位点特异性重组事件由cre重组酶介导。
56.一种核酸载体，所述核酸载体包含：
57.根据权利要求56所述的载体，其中所述异源序列包含异源基因。
58.根据权利要求57所述的载体，其中所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
59.根据权利要求57或58所述的载体，其中所述异源序列包含表达控制序列。
60.根据权利要求59所述的载体，其中所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
61.根据权利要求59或60所述的载体，其中所述表达控制序列包含组织特异性启动子。
62.根据权利要求61所述的载体，其中所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(ttp)或鼠甲状腺素转运蛋白(mttr)启动子。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的载体，其中所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
64.根据权利要求63所述的载体，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。
65.根据权利要求59-64中任一项所述的载体，其中所述表达控制序列包含转录后调节元件。
66.根据权利要求65所述的载体，其中所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的载体，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
68.根据权利要求67所述的载体，其中所述治疗性蛋白质是凝血因子。
69.根据权利要求66所述的载体，其中所述凝血因子是因子viii(fviii)。
70.根据权利要求68或69所述的载体，其中所述凝血因子是fviii-xten。
71.根据权利要求56-70中任一项所述的载体，其中所述异源序列包含5'反向末端重复序列(itr)。
72.根据权利要求56-71中任一项所述的载体，其中所述异源序列包含3'反向末端重复序列(itr)。
73.根据权利要求71或72所述的载体，其中所述5’itr和所述3’itr衍生自细小病毒。
74.根据权利要求73所述的载体，其中所述细小病毒选自b19、gpv、hbov1和aav2。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’itr是衍生自b19的野生型或变体5’itr。
76.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’itr是衍生自gpv的野生型或变体5’itr。
77.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’itr是衍生自aav2的野生型或变体5’itr。
78.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’itr是衍生自hbov1的野生型5’itr。
79.根据权利要求75-77中任一项所述的载体，其中所述变体5’itr是截短型5’itr。
80.根据权利要求71-79中任一项所述的载体，其中所述3’itr是衍生自b19的野生型或变体3’itr。
81.根据权利要求71-78中任一项所述的载体，其中所述3’itr是衍生自gpv的野生型或变体3’itr。
82.根据权利要求71-78中任一项所述的载体，其中所述3’itr是衍生自aav2的野生型或变体3’itr。
83.根据权利要求71-78中任一项所述的载体，其中所述3’itr是衍生自hbov1的野生型3’itr。
84.根据权利要求80-82中任一项所述的载体，其中所述变体3’itr是截短型3’itr。
85.根据权利要求56-76中任一项所述的载体，其中所述第一复制起点是以pi蛋白的存在为条件的。
86.根据权利要求85所述的载体，其中所述第一复制起点是r6kγ。
87.根据权利要求85或86所述的载体，其中所述第一细菌株包含pi蛋白。
88.根据权利要求56-87中任一项所述的载体，其中所述第二复制起点是puc57。
89.根据权利要求56-88中任一项所述的载体，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
90.根据权利要求89所述的载体，其中所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
91.根据权利要求56-90中任一项所述的载体，其中所述报告基因编码荧光蛋白。
92.根据权利要求91所述的载体，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
93.根据权利要求56-92中任一项所述的载体，其中所述优先靶位点包含loxp位点或其变体。
94.根据权利要求56-93中任一项所述的载体，其中所述位点特异性重组事件由cre重组酶介导。
95.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
96.根据权利要求95所述的重组杆粒，其中所述第一异源序列包含第一异源基因。
97.根据权利要求96所述的重组杆粒，其中所述第一异源序列包含与编码蛋白质的序列可操作地连接的表达控制序列。
98.根据权利要求97所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。
99.根据权利要求98所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期启动子。
100.根据权利要求99所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的rep蛋白。
102.根据权利要求97-101中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是细小病毒rep蛋白。
103.根据权利要求102所述的重组杆粒，其中所述细小病毒rep蛋白选自b19 rep、aav2rep、hbov1 rep和g...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘童瑶，A·马戈迪亚，P·扎卡斯，
申请(专利权)人：比奥维拉迪维治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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