【技术实现步骤摘要】
专利技术涉及一种生产靛蓝的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
1、靛蓝(c16h10n2o2)是一种深蓝色的水溶性非偶氮元类着色剂，其天然来源主要是某些植物，如木蓝、菘蓝、蓼蓝及马蓝等，其使用历史悠久，从古代的纺织品染色到现代的牛仔布料、美容、医疗等多个领域都有广泛应用，全球对靛蓝的年需求量高达5万吨。靛蓝作为染料在纺织品染色上的应用广泛，例如靛蓝在牛仔布料染色中能够赋予牛仔裤经洗涤后的独特磨损效果，因此成为牛仔裤产业中不可或缺的染料。此外，天然靛蓝还被广泛用于染发剂、数字纺织品印刷油墨等领域，并作为食品添加剂被加入果蔬汁饮料、蜜饯、凉果等多样食品中。靛蓝化合物还具有多方面的药用潜能，包括抗惊厥、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、镇痛以及抗癌等。
2、当前靛蓝的合成方法主要包括化学合成和植物提取两种方式，但自然提取法和化学合成法都存在各自的缺陷。化学合成方法如邻硝基苯基丙酸法、β-苯胺乙醇法等，提高了靛蓝的产量和合成效率(收率约97％)，但这些方法涉及使用有毒有害的化学物质，如苯胺、邻苯二甲酸等，不仅对操作人员的健康构成潜在风险，还会造成严重的环境破坏。此外，从植物中提取靛蓝虽然较为环保，但由于植物中的靛蓝含量往往不高，最多只能达到2％，而且提取过程繁琐、成本高昂且产量有限，无法满足产业需求。鉴于上述方法的限制，使用代谢工程技术构建一种高效的重组大肠杆菌生产靛蓝的方法提供了一种创新解决方案。利用基因工程技术改造大肠杆菌，使之能够以色氨酸为前体，通过一系列生物催化反应，高效地生产靛蓝。这一过程不
技术实现思路
1、作为极具前景的绿色合成策略，本专利技术利用代谢工程打造更高效的生产菌株是极有潜力的靛蓝制备方式。基于大肠杆菌bl21(de3)菌株，引入了来源于methylophagaaminisulfidivorans的mafmo基因，通过基因敲除及载体构建等代谢工程方法构建工程菌株，以期实现以色氨酸为前体的生产靛蓝工程菌。
2、针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了以下高效生产靛蓝的重组大肠杆菌及其构建方案。
3、本专利技术构建的重组大肠杆菌是以bl21(de3)为出发菌株，敲除基因组上的色氨酸酶基因tnaa和分枝酸变位酶(cm)/预苯酸脱水酶(pd)双功能酶蛋白基因phea得到菌株bltb；然后敲除氨酸阻遏蛋白基因trpr得到菌株bltc，从以上菌株出发，利用pcoladuet-1载体游离过表达了tnaa和mafmo(核苷酸序列如seq id no.1示)，且利用启动子ptac强化启动载体上各基因的表达，分别得到改造成功后的目的菌株blt1、blt2、blt3，其中，blt3具有更强的靛蓝生产能力。
4、根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述色氨酸阻遏蛋白基因trpr的gene id为948917，所述色氨酸酶基因tnaa的gene id为948221，所述双功能酶蛋白基因phea的gene id为947081。
5、本专利技术的第一个目的是提供一种生产靛蓝的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了基因trpr、phea和tnaa，游离表达tnaa和mafmo。
6、在一种实施方式中，利用大肠杆菌表达载体游离表达tnaa和mafmo。
7、在一种实施方式中，所述大肠杆菌表达载体包括pcoladuet-1、prsfduet-1、pet系列载体。
8、在一种实施方式中，所述trpr的gene id为948917，所述tnaa的gene id为948221，所述phea的gene id为947081，所述mafmo的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9、在一种实施方式中，利用强启动子起始基因tnaa、mafmo的表达。
10、在一种实施方式中，所述强启动子包括启动子ptac。
11、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌bl21(de3)。
12、在一种实施方式中，所述启动子ptac的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13、本专利技术的第二个目的是提供一种生产靛蓝的方法，所述方法是在含有色氨酸的发酵培养基中，利用所述重组大肠杆菌发酵生产靛蓝。
14、在一种实施方式中，以甘油或葡萄糖为碳源。
15、在一种实施方式中，所述发酵培养基包括m9、r/2或mr培养基。
16、在一种实施方式中，所述发酵培养基中色氨酸含量为1～5g/l。
17、在一种实施方式中，所述m9培养基包括6.8g/l磷酸氢二钠，3g/l磷酸二氢钾，0.5g/l氯化钠，1g/l氯化铵，0.4929g/l七水硫酸镁，0.02g/l氯化钙，4g/l葡萄糖。
18、在一种实施方式中，所述r/2培养基发酵体系中还含有3g/l酵母提取物，3g/l硫酸铵，2g/l磷酸氢二铵，6.75g/l磷酸二氢钾，0.85g/l柠檬酸，0.7g/l七水硫酸镁和5ml/l微量金属元素。微量金属元素包括5mol/l盐酸，10g/l七水硫酸亚铁，2.25g/l七水硫酸锌，1g/l五水硫酸铜，0.5g/l五水硫酸锰，0.23g/l十水硼酸钠，2.0g/l二水氯化钙，0.1g/l四水钼酸铵，20g/l甘油。
19、在一种实施方式中，所述mr培养基发酵体系中还含有6.67g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二铵，0.8g/l七水硫酸镁，0.8g/l柠檬酸和10ml/l微量金属元素。微量金属元素包括：10g/l七水硫酸亚铁，1.35g/l无水氯化钙，2.2g/l七水硫酸锌，0.58g/l四水硫酸锰，1g/l五水硫酸铜，0.2g/l十水硼酸钠，0.1g/l四水钼酸铵，10g/l葡萄糖。
20、在一种实施方式中，所述方法为将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，在35～38℃发酵培养至od6000.6～0.8后，加入终浓度为0.05～1.0mm iptg，28～32℃培养至少48h。
21、本专利技术的第四个目的是提供了所述重组大肠杆菌在制备靛蓝或含有靛蓝的产品中的应用。
22、本专利技术的第五个目的是提供了所述重组大肠杆菌在食品、化工、医药领域中的应用。
23、有益效果：
24、本专利技术以大肠杆菌bl21(de3)工程菌为出发菌株，通过表达含黄素单加氧酶，并对靛蓝的合成通路做了一系列代谢工程改造，以及对培养基体系进行一系列优化，最终得到的重组大肠杆菌在摇瓶发酵条件下靛蓝产量达1.122g/l。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种生产靛蓝的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，敲除基因组上的色氨酸酶基因tnaA和分枝酸变位酶(CM)/预苯酸脱水酶(PD)双功能酶蛋白基因pheA、色氨酸阻遏蛋白基因trpR，游离表达色氨酸酶基因tnaA和含黄素单加氧酶基因maFMO；所述maFMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用大肠杆菌表达载体游离表达tnaA和maFMO。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体包括pCOLADuet-1、pRSFDuet-1、pET系列载体。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用强启动子起始基因tnaA、maFMO的表达。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强启动子包括启动子Ptac。
6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种生产靛蓝的方法，其特征在于，所述方法是在含有色氨酸的发
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以甘油或葡萄糖为碳源。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中色氨酸含量为1～5g/L。
10.权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌在制备靛蓝或含有靛蓝产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种生产靛蓝的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，敲除基因组上的色氨酸酶基因tnaa和分枝酸变位酶(cm)/预苯酸脱水酶(pd)双功能酶蛋白基因phea、色氨酸阻遏蛋白基因trpr，游离表达色氨酸酶基因tnaa和含黄素单加氧酶基因mafmo；所述mafmo的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用大肠杆菌表达载体游离表达tnaa和mafmo。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体包括pcoladuet-1、prsfduet-1、pet系列载体。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用强启动子...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。